22210

rozpuszczalnika organicznego (metanol, acetonitryl) w wodzie. Związki chromatografowane w takich warunkach opuszczają kolumnę w kolejności zminiejszającej się ich polarności.

Jeśli są to substancje jonowe to w celu poprawy efektywności chromatografowania do fazy ruchomej dodaje się sole, kwasy i roztwory buforowe.

5) Związki jonowe chromatograf uje się na wymieniaczach jonowych, stosując roztwory buforowe jako eluenty.

Eluenty izoeluotropowe - to mieszaniny rozpuszczalników mające różny skład, ale jednakową moc elucyjną. Mogą mieć różną selektywność, dzięki czemu bez zmiany retencji substancji chromatografowanych można lepiej rozdzielić składniki mieszaniny.

Do określenie przybliżonego składu eluentów izoeluotropowych służy nomogram.

Detektory:

W HPLC używane są przede wszystkim detektory spektrofotometryczne lub elektrochemiczne.

Ich zasada działania polega na rejestrowaniu różnicy określonej właściwości samego eluentu i roztworu substancji chromatografowanej w tym eluencie.

Najbardziej rozpowszechnionym detektorem w chromatografii cieczowej kolumnowej są detektory działające na zasadzie absorpcji światła nadfioletowego (UV) lub nadfioletowego i widzialnego (UV-Vis). Najprostsze monochromatyczne detektory UV umożliwiają wykrywanie chromatografowanych substancji przy jednej długości fali - 254nm. Jest to długość fali światła pochłanianego przez większość substancji organicznych (65%), a jednocześnie łatwa do uzyskania technicznie za pomocą lampy rtęciowej.

Obecnie powszechnie stosowane są detektory spektrofotometryczne, w których możliwa jest płynna regulacja długości fali światła w całym zakresie nadfioletu i jego części widzialnej (190-600nm). Taki detektor po zatrzymaniu przepływu fazy ruchomej umożliwia rejestrację widma absorpcji substancji znajdującej się w detektorze i ustalenie długości fali, przy której występuje maksimum absorbancji, co pozwala na wykrycie substancji z maksymalną czułością.

AbX-d£tęktorJ^_dgbiŁe_dziąiał_^yty_ęluentjT[e..pgwin[en^soi^ować^wiadą_BJ2y^a§t05gw^ęj. długości fali.

Detektor UV jest niewrażliwy na zmiany przepływu fazy ruchomej i na zmiany temperatury.

Zasada działania:

-    światło lampy deuterowej jest skupione przez układ optyczny w komórce przepływowej, w której część światła jest absorbowana przez wykrywane substancje.

-    następnie promień światła rozszczepiany na siatce dyfrakcyjnej pada na matrycę diodową (diody mogą rejestrować intensywność światła w zakresie 190-600nm w ciągu lOms)

-    każda fotodioda przeznaczona jest do pomiaru wąskiego spektrum światła. Jednoczesna rejestracja prądów z poszczególnych fotodiod umożliwia rejestrację całego widma absorpcji analizowanego związk u chemicznego.

Detektor ten umożliwia stwierdzenie czy pik eluowany z kolumny, odpowiada jednej substancji czy może w jednym piku mieszczą się dwie substancje. Możliwe jest także wykonanie analizy ilościowej składników ukrytych w jednym piku.

Detektor fluorescencyjny

Istota detekcji fluorescencyjnej polega na pomiarze intensywności światło o określonej długości fali emitowanego przez wykrywany związek w wyniku jego wzbudzenia, które odbywa się światłem o większej energii niż światło emitowane.

Jest najbardziej specyficznym i selektywnym detektorem spośród wszystkich detektorów w chromatografii cieczowej.

Detekcja za pomocą detektora fluorescencyjnego jest najprostsza wówczas gdy wykrywany związek ma naturalną zdolność do fluorescencji. Jeśli nie to przeprowadza się związki niefluoryzujące we fluoryzujące. Wykonuje się to przed lub za kolumną dodając do analizowanej próbku lub do eluentu odzcynniki (np. chlorek densylu), które reagując ze związkami analizowanymi, tworzą ich fluoryzujące pochodne.

Stosując detektor fluorescencyjny należy pamiętać, że na uzyskane efekty detekcji wpływ ma rodzaj elementu.