101646

SacI: Rozpoznawana sekwencja: 5’ GAGCTC 3’ którą tnie: 5’ GAGCT C 3’

3’ CTCGAG 5’    3'C TCGAG 5'

•    Organizm: Streptomyces achromogenes

•    Produktem reakcji enzymatycznej katalizowanej przez SacI są lepkie końce 3*

11ind111: Rozpoznawana sekwencja: 5’ AAGCTT 3’ którą tnie: 5’ A AGCTT 3’

3' TTCGAA 5’    3' TTCGA A 5'

•    Organizm: Haemophilus influenzae

•    Produktem reakcji enzymatycznej katalizowanej przez Hindlll są lepkie końce 5’

4.    Opis zasady klonowania kierunkowego.

Klonowanie DNA- polega na umieszczeniu fragmentu DNA wektorze do klonowania, a następnie namnożeniu rekombinowanej cząsteczki w organizmie gospodarza. Klonowanie DNA umożliwiają enzymy restrykcyjne i ligaza DNA. W procesie klonowania DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych wycinamy z DNA określone fragmenty i łączymy za pomocą ligazy DNA z wektorem plazmidowym hydrolizowanym tym samym enzymem restrykcyjnym W celu uniknięcia cyrkularyzacji, czyli zamknięcia się wektora usuwamy grupy fosforanowe, obecne na końcu 5' wektora- defosforylacja przy użyciu fosfatazy alkalicznej.

Klonowanie kierunkowe- fragment może ulec włączeniu w wektor tylko w jednej wybranej orientacji. Jest

wynikiem ligacji komplementarnych „lepkich” końców znajdujących się plazmidzie (wektorze) i we wstawce, które powstały na skutek trawienia identycznymi enzymami restrykcyjnymi

5.    Opis zasady elektroforezy preparatywnej (izolacji DNA z żelu agarozowego).

Elektroforeza- to rozdział cząsteczek dodatnio lub ujemnie naładowanych w wyniku migracji w polu elektrycznym. Przebieg elektroforezy można monitorować nanosząc (na osobnych ścieżkach lub razem z preparatem) specjalne barwniki o znanej mobilności elektroforę tycz nej. Po zakończeniu procesu żel wydobywa się z aparatu i analizuje przez wybarwienie (u nas roztworem błękitu metylenowego przez 20 minut). Do barwienia można też użyć bromku etydyny, który interkałuje pomiędzy zasady azotowe. Widzimy więc kompleks DNA z bromkiem etydyny, bo tam świecenie jest 20x więsze. Następnie wypłukuje się    barwnik.

Elektroforeza preparatywna- umożliwia izolację tej części preparatu, którą chcemy wykorzystać w dalszych badaniacli

1)    wycinamy skalpelem kawałki żelu, zawierającego odpowiednie fragmenty wektora i wstawki.

2)    ważymy, dodajemy wody

3)    r-ór „hin(ling solution” (pomaga zaadsorbować próbki w podłożu, do degradacji agarozy), ink do całkowitego rozpuszczenia agarozy w temp 55°C

3)    zawiesina krzemionki- do niej adsorbuje się DNA (osadza się na niej). Wir, usunięcie supematantu

4)    osad w „wash buffer”, wir, usunięcie supematantu, czynność powtarzamy (lepsze oczyszczenie DNA)

5)    TE do osadu- odłączanie DNA od krzemionki, wir, supernatant do dalszych badań