112963

Genetyka molekularna wykład 10

Hybrydyzacja z sondami molekularnymi - analiza restrykcyjna

Hybrydyzacja z sondami molekularnymi - wykrywanie rekombinantów

Filtr nitrocelulozowy -> nałożyć filtr na płytkę z oddzielonymi koloniami bakterii -> dalszy wzrost

płytka -> owrócony filtr umieścić na nowej płytce agarem, wzrost kolonii bakterii -> replika płytki na świeżym agarze -> filtr z przytwierdzonymi koloniami zanurzać w kolejnych buforach -> denaturacja, neutralizacja przemywanie, suszenie DNA i wiązanie -> DNA bakterii związany na filtrze -> hubrdyzacja ze znakowana sondą, przemywane, autoradiografia, -> klisza fotograficzna, -> identyfikacja pozytywnych kolonii i przeniesienie do pożywek płynnych

płytka oryginalna ->, identyfikacja pozytywnych kolonii i przeniesienie do pożywek płynnych -> namnażacle w hodowli płynnej

Transfer northerna - sondy molekularne do badań RNA

Badany DNA -> nakładanie do kiszonek na denaturującym żelu agarozowy -> migracja -> przeniesienie na filtr nitrocelulozowy -> przeniesienie RNA na filtr -> hybrydyzacja sondy z unieruchomionym RNA -> usuwanie nadmiaru sondy molekularnej -> nałożenie kliszy fotograficznej -> wywołanie kliszy

filtr może być używany wielokrotnie z różnymi sondami

Hybrydyzacja z sondami molekularnymi - macierze - mapowanie fizyczne

Mikromacierz DNA o powierzchni lcm2 zawierająca 1046 klonów z biblioteki cDNA komórek krwi. Sondę cDNA wyznakowaną fluorescencyjnie stanowi cDNA szpiku kostnego, przygotowany zastosowaniem odwrotnej traskryptazy. Odczytu dokonano z zastosowaniem mikroskopu konfokalnego.

Hybrydyzacja sondami molekularnymi - Mikormacierze DNA

źródło światła -> fotomaska -> wrażliwe na światło grupy chroniące -> płytka szklana ze struktura siatki -> synteza T- -> powtarzające się etapy ochrony przed światłem i syntezy -> synteza

Powstawanie macierzy oligonukleotydowej w wyniku fotolitografii oraz syntezy In situ oligonukleotydów. Miejsca syntezy stają się aktywne po naświetleniu, co umożliwia syntezę określonych, specyficznych oligonukleotydów.