MIKROBIOLOGIA PRZEMYSŁOWA

wykład: prof. dr hab. Zdzisława Libudzisz

laboratorium: dr inż. Krystyna Kowal

METABOLIZM KOMÓRKOWY - schemat

Szybkość rozmnażania się mikroorganizmów zależnie od gatunku może wynosić od 15 minut do kilku dni (dla większości bakterii 40 - 180 minut).

Gdy genofor jest replikowany w czasie około 40 minut, to oznacza:

• w ciągu 1 sekundy ponad 5000 nukleotydów jest dołączonych do tworzącego się łańcucha DNA

• transkrypcja mRNA trwa około 2 - 3 sekundy

• proces translacji (syntezy cząsteczki białka) trwa około 5 sekund.

Intensywność procesów katabolicznych mierzona ilością CO₂ uwalnianego z glukozy w czasie 1 godziny/g s.m. komórki wynosi:

• bakterie Azotobacter (tlenowe) 2000 ml CO₂/godz. * 1 g s.m.

• Bakterie Lactobacillus (fermetacyjne) 300 ml CO₂/godz. * 1 g s.m.

• Komórki wątroby człowieka 10 - 20 ml CO₂/godz. * 1 g s.m.

• Komórki roślinne 0,4 - 0,5 ml CO₂/godz. * 1 g s.m.

Opis sposobu odżywiania się mikroorganizmów wymaga odpowiedzi na pytania:

1. Co jest źródłem energii metabolicznej - energia jest niezbędna dla komórek do wykonania pracy chemicznej np. biosyntezy, pracy osmotycznej i miechanicznej

2. Co jest źródłem węgla do syntezy składników komórkowych?

3. Co jest donorem elektronów i protonów w układzie przenośników (transport przez błony)?

CHEMOTROFY

Mikroorganizmy, które uzyskują energię w wyniku przemian oksydoredukcyjnych organicznych lub nieorganicznych związków chemicznych.

Źródło węgla: CO₂, związki organiczne.

CHEMOLITOTROFY (chemoautotrofy)

Organizmy korzystające z energii zawartej w zredukowanych związakch nieorganicznych, np azotu, siarki, żelaza lub energii zawartej z H₂.

Źródło elektronów: zredukowane związki takie jak NH₃, CO, H₂S, S, Fe²⁺.

Źródło węgla: CO₂ lub związki organiczne.

Do tej grupy zaliczamy m.in. archeony (metanogenne), bakterie nitryfikacyjne, bakterie wodorowe, żelaziste i inne.

CHEMOORGANOTROFY (organotrofy)

Mikroorganizmy, które wykorzystują związki organiczne jako źródło węgla, energii i elektronów (donory wodoru). Są to wszystkie grzyby, większość bakterii, pierwotniaków i zwierzęta.

FOTOAUTOTROFY (fotolitoautotrofy)

Wykorzystują energię słoneczną.

Źródło węgla: CO₂.

Źródło elektronów: związki nieroganiczne.

Zaliczamy do nich:

• beztlenowe bakterie fototroficzne, których proces fotosyntezy nie uwalnia do środowiska tlenu (np purpurowe, bakterie siarkowe),

• tlenowe mikroorganizmy fototroficzne, które w obecności światła wytwarzają tlen (np sinice - prokariota, grzyby - eukariota).

Chemoorganotrofy - przemiany sacharydów

1. Rozkład (di-, oligo-, polisacharydów) do cukrów prostych przez zewnątrzkomórkowe lub wewnątrzkomórkowe enzymy hydrolizujące.

2. Przemiana cukrów prostych do pirogronianu (szlaki EMP, HMP, ED, fosfoketolazy pentozowej).

3. Przekształcenie pirogronianu do:

- produktów organicznych (fermentacja)

- CO₂ + H₂O (oddychanie tlenowe)

Przemianom etapu 2. i 3. towarzyszy tworzenie energii. Etap 1. jest etapem energochłonnym.

Skrobia - D - glukan złożony z amylozy I amylopektyny. Amyloza składa się z reszt glukozy połączonych wiązaniami α(1,4). W amylopektynie do α(1,4) glukanu dołączone są dalsze cząsteczki glukanu wiązaniami α(1,6).

Amylazy (kompleks enzymów) - niektóre są endoglukanazami (α - amylazy), hydrolizują wewnętrzne wiązania α(1,4) glikozydowe (powstaje mieszanina maltozy, maltotriozy I oligosacharydy), inne są egzoglukanazami (β - amylazy) (od końca nieredukującego, uwalnia się maltoza). Maltaza rozszczepia maltozę na dwie cząsteczki glukozy.

Cząsteczka celulozy - liniowy polimer glukozy, zbudowany z 100 - 1000 podjednostek połączonych wiązaniami β(1,4). Równoległe cząsteczki liniowe są połączone wiązaniami wodorowymi.

Celulazy - enzymy rozkładające celulozę, występują u wielu grzybów oraz u niektórych bakterii i pierwotniaków. Celulazy (wydzielane pozakomórkowo) mogą wykazywać aktywność endoglukanaz.

ODDYCHANIE

Jest procesem katabolicznym, w którym utlenienie związków organicznych lub nieorganicznych jest sprzężone z syntezą ATP w procesie fosforylacji oksydacyjnej, a końcowymi akceptorami elektronów są związki egzogenne. Energia zawarta w substracie jest stopniowo uwalniana w serii sprzężonych reakcji utleniania - redukcji, którym towarzyszy transport elektronów w łańcuchu oddechowym.

W skład łańcucha oddechowego wchodzą conajmniej 2 kompleksy enzymatyczne - dehydrogenaza I końcowa oksydoreduktaza. W bardziej kompletnych łańcuchach występują dodatkowo enzymy lub białka pzenoszące elektrony.

Łańcuch oddechowy u eukariontów jest umiejscowiony w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, a u prokariontów w błonach mezosomów, lub w błonie cytoplazmatycznej.

W oddychaniu tlenowym końcowym akceptorem eletronów jest tlen, a w oddychaniu beztlenowym - inne pierwiastki I związki (organiczne lub nieorganiczne). Oddychanie tlenowe daje mikroorganizmom większy zysk energetyczny, a związki organiczne (takie jak glukoza) utlenione są do związków obojętnych (CO₂, H₂O).

UTLENIANIE PIROGRONIANU - ODDYCHANIE TLENOWE

Pirogronian + CoA + NAD → Acetylo-CoA + NADH⁺ + H⁺ + CO₂

↓

Cykl Krebsa

3NADH+H+ → 1ATP, 2CO₂

1FADH+H+

↓

Łańcuch oddechowy

↓

CO₂ + H₂O

Glukoza (EMP) + Cykl Krebsa + Łąńcuch oddechowy → 38 ATP

Łańcuch oddechowy - przenoszenie elektronów (eukariota, niektóre bakterie tlenowe)

Struktura łańcucha oddechowego prokariota może być specyficzna dla danego gatunku I warunków środowiskowych (zawartość tlenu).

Toksyczny wpływ tlenu na mikroorganizmy.

Toksyczne działanie tlenu może być:

• bezpośrednie np. utlenione grupy -SH w białkach, inaktywacja niektórych enzymów, nadoksydacja cytochromów, lipidów

• pośrednie, działanie toksycznych połączeń tlenu.

Toksyczne połączenia tlenu:

• wolne rodniki nadtlenkowe (O₂^-): O₂ + e^- → O₂^-

• nadtlenek wodoru (H₂O₂): O₂ + 2e^- → O₂^2-

• rodniki hydroksylowe (OH^-): O₂ + H₂O + H⁺ → O₂ + H₂O + OH^-

Reakcja 1. jest katalizowana przez oksydazę cytochromową I niektóre enzymy zawierające Cu (tyrozyna, lakaza). Reakcja 2. jest charakterystyczna dla niektórych enzymów z grupą flawinową (oksydaza glukozowa, aminokwasowa, ksantynowa). Reakcja 3. jest katalizowana przez wiele oksydaz (ksantynowa, aldehydowa).

Ochronne działanie wykazują enzymy:

2H₂O₂ → 2H₂O + O₂ (katalaza)

2H₂O₂ + NADH → 2H₂O + NAD⁺ (peroksydaza)

2O₂^- + 2H⁺ → H₂O₂ +O₂ (desmutaza nadtlenkowa)

4O₂^- + 4H⁺ → 2H₂O + 3O₂ (desmutaza nadtlenkowa/katalaza)

Prowadząc hodowle mikroorganizmów tlenowych należy pamiętać, że pomimo, iż tlen jest niezbędnym związkiem dla ich wydajnego metabolizmu, zbyt wysokie stężenie może być jednak niebezpieczne (toksyczne połączenia tlenu).

Oddychanie beztlenowe

Końcowymi akceptorami elektronów są inne niż tlen pierwiastki lub utlenione związki nieorganiczne I organiczne (siarka pierwiastkowa, azotany, tlenki azotu, siarczany, Fe (II), Mn (IV), nadchlorany, chlorany, arseniany, CO₂, fumaran I inne związki). Zależnie od rodzaju akceptora mówimy o oddychaniu azotanowym, siarczanowym, fumaranowym itp.

Oddychanie beztlenowe - proces denitryfikacji

Fe-S CoQ cyt b reduktaza azotanowa V

cyt cd reduktaza azotanowa III

cyt bc1 reduktaza tlenku azotu, reduktaza podtlenkowa

BEKTERIE CHEMOLITROFICZNE

Większość to mikroorganizmy tlenowe, pospolicie występujące w środowisku naturalnym, biorą udział w obiegu pierwiastków w przyrodzie, wykorzystywane do oczyszczania ścieków, ługowania metali. Niektóre wyspecjalizowane w sposobie uzyskiwania en. (np. Nitrosomonas - wyłączenie utlenianie NH₃) inne mogą wykorzystywać kilka nieorganicznych donorów elektronów (np. Acitobacillus ferroxidans - związki siarki, Fe (II), wodoru).

Potencjał redox: ………………………………………………………………………….

…………………………………………………………..

Red. NAD (gdy donory wodoru mają wyższy potencjał redox niż NAD) zachodzi na drodze odwróconego transportu elektronów napędzanego przez ATP (NADH₂ jest niezbędny do red. CO₂). Elektrony wchodzą do łańcucha oddechowego dopiero na poziomie cyt a lub cyt z (zysk energetyczny jest mały).

FOTOSYNTEZA

Mikroorganizmy: glony, niektóre bakterie (sinice oraz bakterie fotosyntezy atoksycznej).

Fotosynteza oksygenowa - proces przekształcania energii świetlnej w energię biochemiczną ATP (fotofosforylacja). Energia świetlna jest też wykorzystywana do oderwania elektronu od cząsteczki wody i przeniesienie go na utlenioną formę NAD(P). Ciag dwóch kolejnych reakcji świetlnych aktywuje elektrony do poziomu wystarczającego do redukcji NAD(P) i do wykorzystania wody jako źródło elektronów.

W fotosyntezie atoksycznej bierze udział pojedyncza reakcja świetlna (fotofosforylacja). Elektrony do reakcji NAD nie pochodzą z wody lecz z innych zredukowanych związków. Fotosynteza oksygenowa jest ewolucyjnie bardziej rozwinięta. Bakterie fotosyntezy atoksycznej są uważane za relikty organizmów oksygenowych. Mikroorganizmy fotosyntetyzujące żyją w wodzie (wody morskie i słodkie), w warstwach dennych płytkich stawów, na powierzchni bagien, gleby, lodowców.

Mikroorganizmy fotosyntetyzujące

Oksygenowe - wytwarzające tlen w czasie fotosyntezy, jako donor elektronów do red. NADP⁺ wykorzystują wodę (glony, sinice).

Anoksygenowe - nie wytwarzają tlenu, donorami elektronów są nieorganiczne związki siarki, wodór, związki organiczne lub Fe (II). Niektóre grupy w ciemności mogą prowadzić metabolizm chemoorganotroficzny.

Bakterie fotosyntezy atoksycznej

Występują pospolicie w środowisku wodnym, warstwach dennych płytkich stawów, wodach wolno płynących, przy brzegach jezior, w górnych warstwach bagien.

Purynowe bakterie bezsiarkowe - Rhodobacter

Występują w jeziorach, stawach, w planktonie morskim (ok. 10%), plastyczny metabolizm - w warunkach beztlenowych i na świetle zachowyją się jak fotolitotrofy (H₂, donor elektronów), w warunkach tlenowych w ciemności stają się organotrofami. Komórki małe (kilka μm), pałeczki, formy spiralne, kuliste.

Purynowe bakterie siarkowe

Występują w warunkach beztlenowych w wodach słodkich i słonych, ściekach, donor elektronów H₂S. Utleniają siarczki do siarki pierwiastkowej, którą gromadzą w komórkach. Różne kształty komórek, z reguły duże (formy nitkowate 3 x 20 - 50 μm, kuliste 3 - 5 μm), często ruchliwe.

Zielone bakterie fotosyntetyzujace:

• nitkowate - rząd Chloroflexales - głównie termofilne, występują w gorących źródłach. W warunkach beztlenowych zachowują się jak fototrofy (donor elektronów H₂ lub H₂S) nie gromadzą siarki w komórkach, w warunkach tlenowych nie wytwarzają bakteriochlorofilu i zachowują się jak organotrofy.

• Siarkowe - rząd Chlorobiales - bezwzględne beztlenowce i fototrofy (donor elektronów - zredukowane nieorganiczne związki siarki), siarkę odkładają w komórkach. Występują w ściekach, wodach słodkich i morskich. Małe pałeczki (0,8 - 2 μm), nieruchliwe.

Barwniki uczestniczące w fotosyntezie

U fototrofów oksygenowych - chlorofile + barwniki pomocnicze

U fototrofów anoksygenowych - bakteriochlorofile + barwniki pomocnicze

Barwniki pomocnicze - karotenoidy (karoteny i ksantofile) oraz fikobiliny (np. fikoerytrobilina, fikocyjanobilina). Zawierają sprzężone wiązania podwójne - zbierają światło i przenoszą do centrum aktywnego chlorofilu lub bakteriochlorofilu. Umożliwiają życie w głębszych warstwach wód, przy mniejszym natężeniu światła słonecznego (karotenoidy, fikobiliny).

FERMENTACJA

ODDYCHANIE TLENOWE

ODDYCHANIE BEZTLENOWE

CHEMOLITOTROFIA

FOTOTROFIA

METABOLIZM KOMÓRKOWY WĘGLA

FIZJOLOGIA WZROSTU MIKROORGANIZMÓW

Skład chemiczny komórek prokariotycznych (sucha masa E. coli = 2.8 * 10^-13)

• Biopolimery 96% s.m. (różnorodność 2500)

• Monomery 3% s.m. (różnorodność 350)

• Składniki nieorganiczne 1% s.m. (różnorodność 18)

Wymagania pokarmowe mikroorganizmów

Głównymi składnikami masy komórkowej mikroorganizmów są:

• Węgiel do 50%

• Tlen do 30%

• Azot do 14%

• Wodór do 8%

• Fosfor do 3%

• Siarka do 1%

Pierwiastki te nazywamy budulcowymi i bez odpowiedniego stężenia, a często rodzaju, któregoś z nich, nawet jeżeli pozostałe będą w nadmiarze, nie jest możliwy rozwój mikroorganizmów.

Hodowle in vitro (w szkle), w pożywkach zdefiniowanych (o znanym składzie chemicznym) lub w pożywkach naturalnych (o częściowo znanym składzie).

Hodowle in vivo - w organizmach żywych (zwierzęta doświadczalne, zarodniki jaj).

Wymagania pokarmowe mikroorganizmów

Grupa I. Skrajnie wymagające (o bardzo wysokich wymaganiach pokarmowych) - należą tu głównie bakterie chorobotwórcze, rozwijające się wyłącznie w środowiskach o pełnym zestawie organicznych połączeń budulcowych i funkcjonalnych. Wśród mikroorganizmów saproficznych szczególnie wysokimi wymaganiami pokarmowymi cechują się bakterie fermentacji mlekowej.

Grupa II. Mikroorganizmy o średnich wymaganiach pokarmowych - występują najliczniej w przyrodzie (środowisko naturalne - żyzna gleba, zanieczyszczona woda, żywność).

Grupa III. Mikroorganizmy o bardzo niskich wymaganiach pokarmowych - należą tu autotrofy węglowe - asymilujące CO₂, autotrofy azotowe - asymilujące azot atmosferyczny np. sinice. Mikroorganizmy o niskich wymaganiach pokarmowych są najczęściej autochtoniczną mikroflorą środowisk wody i nieraz gleby.

Wymagania pokarmowe mikroorganizmów są odwrotnie proporcjonalne d wyposażenia enzymatycznego i zdolności biosyntetycznych mikroorganizmów

Najbardziej rozbudowanym systemem anabolicznym cechują się mikroorganizmy o najniższych wymaganiach pokarmowych. Z najprostszych składników mineralnych potrafią zbudowac w pełni funkcjonalna komórkę.

Drobnoustroje o wysokich wymaganiach pokarmowych np. chorobotwórcze, cechują się bardzo ubogim metabolizmem anabolicznym - muszą korzystać z gotowych połączeń organicznych.

WZROST DROBNOUSTROJÓW

• Wzrost osobniczy

Przyrost biomasy i objętości organizmu jednokomórkowego (np. komórki drożdżowej lub bakteryjnej) lub wielokomórkowego(np. strzępki grzybni) w wyniku biosyntezy substancji komórkowej, takich jak białka, kwasy nukleinowe, sacharydy, służących do tworzenia struktur komórkowych: błon komórkowych, rybosomów, jądra, mitochondriów.

• Wzrost populacyjny

Wzrost populacji, tzn. zwiększenie liczby Komorek w populacji drobnoustrojów.

Wzrost - powiększenie ilości żywej substancji - zwiększenie liczby komórek bądź masy komórek.

Modelowy wzrost mikroorganizmów jednokomórkowych

HODOWLE MIKROORGANIZMÓW

W systemie otwartym - składniki pokarmowe są ze stałą szybkością wprowadzane do naczynia hodowlanego, a biomasa wraz z przefermentowanym podłożem jest odprowadzana z taką samą szybkością. Przykładem systemu otwartego jest hodowla ciągła.

W systemie zamkniętym - (hodowla okresowa) - mikroorganizmy rosną w naczyniu bez wymiany podłoża. Podczas hodowli mikroorganizmów skład podłoża stopniowo ubożeje w składniki odżywcze, a gromadzą się produkty metabolizmu. Mikroorganizmy rozwijają się w środowisku do momentu wyczerpania któregoś z budulcowych składników odżywczych (limitacja pokarmowa) lub do momentu nagromadzenia się produktów metabolizmu w dawkach, które są dla mikroorganizmów toksyczne (inhibicja). Ze względu na zmieniające się warunki mikroorganizmy przechodzą fazy fizjologiczne i biochemiczne czyli fazy rozwojowe, których przebieg ilustruje tzw. krzywa wzrostu, ujmująca zależność liczby lub masy mikroorganizmów od czasu hodowli.

Krzywa wzrostu mikroorganizmów

1. faza adaptacyjna

2. faza przyspieszenia

3. faza logarytmiczna

4. faza wzrostu opóźnionego

5. faza stacjonarna

6. faza zamierania

Faza adaptacyjna (lag faza, faza zastoju)

Trwa od momentu inokulacji pożywki do czasu pierwszych podziałów (pączkowania komórek) mikroorganizmów. W tym czasie zwiększa się objętość komórek, ich masa oraz wzrasta zawartość RNA i białka (nawet o 8 - 12 razy) w komórkach.

Czas trwania fazy adaptacyjnej zależy od:

cech gatunkowych mikroorganizmów

składu podłoża hodowlanego

wielkości i wielu inokulum (stanu fizjologicznego)

parametrów fizycznych (temperatura, pH)

Inokulum pochodzące ze starej hodowli, nieoptymalne warunki hodowlane mogą powodować wydłużenie lag-fazy i mogą być przyczyną rozwoju mikroflory zakażającej. Stosowanie jako inokulum komórek pochodzących z końca fazy logarytmicznej lub wczesnej stacjonarnej zapewnia skrócenie czasu fazy adaptacyjnej. Czas trwania fazy adaptacyjnej nie wpływa na szybkość rozwoju drobnoustrojów w pozostałych fazach rozwojowych.

Zmiana synteza związków wysokocząsteczkowych po przeniesieniu na podłoże bogatsze - „Shift up”

Dwufazowy wzrost (diauksja) w podłożu z różnymi sacharydami

Wyznaczanie czasu trwania fazy adaptacyjnej

Faza logarytmiczna

W fazie logarytmicznej mikroorganizmy rozmnażają się z jednakową i najwyższą szybkością. Wartość dx/dt (dN/dt) jest stała.

Szybkość wzrostu drobnoustrojów zależy od:

cech gatunkowych (szczepowych) drobnoustrojów

składu pożywki (stężenia i rodzaju składników odżywczych, zawartości szkodliwych produktów metabolizmu)

parametrów fizycznych hodowli (temperatura, pH, aktywność wody, potencjał redox).

Właściwa szybkość wzrostu (μ, h^-1)

μ = 1/N * dN/dt; μ = 1/X * dX/dt

Maksymalna wartość właściwej szybkości wzrostu (μ_max) występuje w warunkach wzrostu nieorganiczonego.

Zmiana szybkości syntezy związków wysokocząsteczkowych po przeniesieniu na podłoże „Shift down”.

Faza stacjonarna

Stała liczba komórek - wynik równowagi pomiędzy liczbą komórek żywych i martwych. Rozmiary komórek mniejsze niż w fazie wzrostu logarytmicznego.

Faza powolnego zamierania

Wzrost liczby komórek martwych, pojawiają się komórki inwolucyjne, zachodzą procesy autolizy. Zmniejsza się liczba komórek i ogólna ilość biomasy.

Faza przyspieszonego (logarytmicznego) zamierania

Rośnie bardzo szybko (nieraz logarytmicznie) liczba komórek martwych. Szybkość zależy od zawartości w pożywce metabolitów toksycznych (etanol, kwasy organiczne, nadtlenek wodoru) oraz od wrażliwości mikroorganizmów. Może prowadzić do całkowitego zniszczenia hodowli.

Zmiany wielkości i składu chemicznego komórek w czasie hodowli okresowej (jednostki umowne)

Parametry wzrostu mikroorganizmów

Wydajność biomasy, plon biomasy (X, g/l) X = X_max - X₀

Wydajność substratowa (Y_X/S) Y_X/S = X_max - X₀/S₀ - S

Produktywność hodowli (P, g biomasy/l*h) P = X - X₀/t

Właściwa szybkość wzrostu (μ, h^-1) μ = 1/N * dN/dt; μ = 1/X * dX/dt

Czas generacji (Tg, h) Tg = ln2/μ

X - masa komórek

N - liczba komórek

S - stężenie substratu

Hodowla ciągła

D = FN; τ = 1/D

gdzie:

D - szybkość rozcieńczania (h^-1)

F - natężenie objętościowe przepływu (dm³/h)

τ - czas średniego przebywania komórek (h)

V - objętość robocza fermentora (dm³)

Wzrost mikroorganizmów w hodowli ciągłej

D (h^-1) - szybkość rozcieńczania

S (g/l) - stężenie substratu

X (g/l) - plon biomasy

DX (g/l*h) - produktywność hodowli

Dc - punkt krytyczny D (punkt wypłukiwania)

Zalety hodowli ciągłej

- brak limitacji wzrostu mikroorganizmów substratem i produktem

- hodowla przebiega w ustalonych warunkach, z pominięciem wpływu czasu, dzięki temu możemy hodować drobnoustroje w określonej fazie rozwojowej - stałość cech fizjologicznych, stałość składu chemicznego biomasy

- populacje i produkty biotechnologiczne otrzymane metodą hodowli ciągłej są bardziej jednolite

- wyższa produktywność procesu, nawet może dochodzić do10 razy

- zmniejszenie czasu pracy na obsługę hodowli (mycie, opróżnianie, sterylizacja aparatury)

- stałość stanu fizjologicznego mikroorganizmów pozwala na matematyczne modelowanie procesu

Wady hodowli ciągłej

- trudność w utrzymaniu warunków jałowych procesu przez długi okres czasu

- częsty brak stabilności genetycznej mikroorganizmów.

METODY POMIARU ILOŚCI MIKROORGANIZMÓW

Metody statyczne

• metody mikroskopowe

• metody hodowlane (metoda płytkowa i jej modyfikacje, metoda rozcieńczeń)

• metody wagowe

• metody spektrofotometryczne

• specyficzne składniki komórek (chityna, ergosterol)

• cytometria przepływowa

• zawartość pierwiastków budulcowych (C, N, P)

Metody dynamiczne

• metody biochemiczne

• metody biofizyczne

METODY MIKROSKOPOWE

Polegają na bezpośrednim liczeniu mikroorganizmów pod mikroskopem. Różnią się sposobem przygotowania próby do analizy, zakresem zastosowania i sposobem przeliczenia drobnoustrojów na jednostkę objętości.

Bezpośrednie liczenie w preparacie mokrym.

Kroplę hodowli lub zawiesiny drobnoustrojów umieszcza się pod szkiełkiem przykrywkowym i określa liczbę komórek w 20 polach widzenia trzech niezależnie przygotowanych preparatów. Zakłada się, że grubość preparatu wynosi 0,01 mm.

Zawartość drobnoustrojów w próbie oblicza się ze wzoru:

gdzie: 1000 - przeliczenie na 1 ml

a - średnia zawartość komórek w polu widzenia

n - rozcieńczenie

r - promień pola widzenia

Błąd metody wynosi 10 % gdy policzy się około 1100 komórek.

LICZENIE W KOMORZE THOMA (hemocytometr)

Podstawową jednostką powierzchni jest kwadrat o wielkości 1/400 mm² (bok = 1/20 mm). Zgrupowane są po 16 w dużym kwadracie o wymiarach 1/25 mm² (bok = 1/5 mm). Po przykryciu szkiełkiem nakrywkowym tworzą się prostopadłościany o objętości 1/4000 mm³. Należy określic liczbę drobnoustrojów w około 40 małych kwadracikach w trzech niezależnie przygotowanych preparatach.

Zawartosc drobnoustrojów w 1 ml wylicza się ze wzoru:

L (ml^-1) = 4 * 10⁶ * a * n

gdzie: n - rozcieńczenie

a - średnia zawartosc komórek w kwadratach komory

Błąd metody wynosi 10% gdy policzy się około 700 komórek.

LICZENIE DROBNOUSTROJÓW METODĄ ROZCIEŃCZEŃ (metoda Listera)

Wynik - określenie NPL w oparciu o tablice MacCredy'ego lub określenie miana.

Miano - najmniejsza objętość analizowanej próby (w ml lub g), po wysiewie której zaobserwowano wzrost drobnoustrojów.

LICZENIE DROBNOUSTROJÓW METODĄ KOCHA

Wprowadzona została w 1881 roku przez Roberta Kocha. Stosowana również do izolowania czystych kultur i obserwacji morfologicznych mikroorganizmów. Zasada metody polega na wysiewie odpowiednio rozcieńczonej zawiesiny drobnoustrojów na podłoże stałe, inkubacji i liczeniu wyrośniętych kolonii. Założeniem metody jest, że z każdej komórki wyrośnie jedna kolonia. Nie jest to prawdą, komórki tworzą bardzo często stałe ugrupowania (układy komórek) tworzące jedną kolonię. Wyniki zatem podaje się jako jtk (jednostki tworzące kolonie).

Przygotowanie odpowiednich rozcieńczeń W jałowym płynie izotonicznym

(tak aby w 1 ml znajdowało się 20 - 30 komórek) (płyn Ringera, fizjologiczny roztwór KCl, woda peptonowa)

Posiew na płytki metodą wgłębną lub powierzchniową

(wgłębnie po 1 lub 0,1 ml rozcieńczonej zawiesiny,

powierzchniowo po 0,1 - 0,2 ml)

Inkubacja płytek w odpowiedniej temperaturze

(od 25 godzin do 7 dni)

Liczenie wyrosłych kolonii

Błąd metody wynosi: 5 % gdy policzy się około 2700 kolonii,

10% gdy policzy się 700 kolonii,

20 % gdy policzy się 200 kolonii.

Schemat wysiewów metodą płytkową Kocha

Założenie: 1 kolonia = 1 komórka

Obliczenia: liczba kolonii na płytce * rozcieńczenie = liczba bakterii/ml

LICZENIE DROBNOUSTROJÓW METODĄ FILTRACJI MEMBRANOWEJ

Liczba koloni, które wyrosły na filtrze odpowiada liczbie drobnoustrojów obecnych w objętości przesączonej przez filtr próby.

PETRIFILM 3M

Petrifilm Enterobacteriaceae identyfikator pH w pożywce wskazuje na zakwaszenie; produkcja gazu widoczna w postaci pęcherzyków.

Petrifilm E. coli wykrywanie E. coli; zawiera chromogen dla β - glukuronidazy.

ORION DIAGNOSTICA HYGICULT (testy łopatkowe)

Hygicult TPC - do określenie ogólnej liczby bakterii

Hygicult E - do określenie liczby bakterii z rodziny Enterobacteriaceae

Hygicult E/β-GUR - do określenia liczby β - glukuronidazo dodatnich z rodziny Enterobacteriaceae

Hygicult Y&F - do określenia liczby drożdży i pleśni

Hygicult CF - do określenia liczby bakterii z grupy coli

OCENA METOD POŚREDNICH I HODOWLANYCH

Metody hodowlane	Metody mikroskopowe
Wady: oznaczenie tylko osobników żywych mikroorganizmy występujące w połączeniach oceniane są jako 1 kom. uwzględniane są jedynie mikroorganizmy zdolne do rozwoju w danych warunkach hodowlanych (podłoże, temperatura, O2) długi czas pomiędzy wysiewem i uzyskanym wynikiem (minimum 7 godz. do 2 tyg)	Wady: możliwość liczenia drobnoustrojów dopiero od pewnego progu stężenia (powyżej 10^5/ml) nie informują o aktywności o żywotności powinny być stosowane głównie do liczenia dużych komórek (drożdże, pleśnie)
Zalety: Możliwość obserwacji morfologicznych zarówno komórek jak i kolonii.	Zalety: Szybka odpowiedź o ilości drobnoustrojów.

Wyniki uzyskiwane metodami bezpośrednimi są ZAWSZE WYŻSZE niż uzyskane metodami hodowlanymi.

METODY WAGOWE

Pomiar mokrej masy drobnoustrojów po odwirowaniu komórek (bakterie, drożdże) lub odsączeniu (drożdże, grzyby strzępkowe). Przyjmuje się, że wilgotna masa zawiera około 10 - 25% suchej masy.

Pomiar suchej biomasy bakterii i drożdży poodwirowaniu, biomasy grzybów strzępkowych po przesączeniu przez sączek, przemyciu komórek wodą i wysuszeniu do stałej wagi w 105°C.

Ograniczenia:

• trudność oddzielenia komórek od pożywki hodowlanej

• stosowane do określania masy drobnoustrojów w pożywkach klarownych

METODY OPTYCZNE

Wykorzystują zależność między gęstością mikroorganizmów w pożywce płynnej a gęstością optyczną (absorbancją) hodowli.

Ograniczenia:

• tylko dla mikroorganizmów jednokomórkowych

• stosowane do określania ilości drobnoustrojów w pożywkach klarownych

METODY BIOCHEMICZNE

Pomiar ilości drobnoustrojów opiera się na określeniu specyficznych produktów metabolizmu mikroorganizmów, aktywności enzymów czy specyficznych składników komórkowych.

• Wzrost zawartości wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) w środowisku jako efekt aktywności lipolitycznej, wzrost zawartości amoniaku (wynik aktywności proteolitycznej), zawartość kwasów (efekt aktywności kwaszącej), produkcja CO₂ (specyficzny metabolizm węglowodanów),

• Aktywność enzymów (dehydrogenazy, katalaza, β-D-glukuronidaza),

• Metabolity (ATP, kwas pirogronowy, endotoksyny)

• Zawartość specyficznych składników komórkowych (chityna, ergosterol)

METODY BIOFIZYCZNE

• Metody oparte na pomiarze zmiany parametru elektrycznego środowiska pod wpływem drobnoustrojów (impedancja, kondunktancja, kapacytancja)

• Metody radiometryczne

• Kalorymetria

• Cytometria przepływowa

ATP BIOLUMINESCENCJA

Stężenie ATP mierzy się w reakcji oksydatywnej dekarboksylacji z zastosowaniem lucyferyny i lucyferazy (z Photinus pyralis). W wyniku tej reakcji wydzielane jest światło w ilości proporcjonalnej do ilości ATP.

reakcja jest zależna od magnezu lub innych jonów na +2 stopniu utlenienia (Mn, Co, Fe, Ni, Zn)

luminescencja najaktywniej zachodzi przy pH 7,8 - 7,9 w temperaturze 25°C

intensywność emisji światła jest prowadzona przy λ=582 nm i jest proporcjonalna do ilości ATP w próbie

uwalnianie ATP z komórek prowadzi się z użyciem kwasów, rozpuszczalników organicznych lub związków powierzchniowo czynnych.

Stężenie ATP wykrywane w technice bioluminescencji wynosi zazwyczaj 0,1 pg (10^-13g), odpowiada zawartości ATP w:

1 komórce drożdżowej

10² komórek bakteryjnych

ok. 0,001 mg różnego rodzaju pozostałości komórek roślinnych lub zwierzęcych stosowanych w produkcji.

Metoda bioluminescencji wykorzystywana jest do badania mikrobiologicznego żywności, wody, leków, kontroli procesów opartych na hodowlach mikroorganizmów (oznaczanie biomasy, dynamiki wzrostu mikroorganizmów) oraz w diagnostyce klinicznej do oznaczania wpływu antybiotyków na przeżywalność drobnoustrojów, ocenie efektu działania leków i dezynfektantów na komórki mikroorganizmów.

Metoda bioluminescencji ATP znajduje szczególnie szerokie zastosowanie do kontroli stanu sanitarnego produkcji oraz skuteczności dezynfekcji i mycia naczyń.

Wyniki pomiaru ATP zależą od:

• Rodzaju żywności

• Jakości powierzchni

• Skuteczności czyszczenia

EKOLOGIA MIKROORGANIZMÓW

Zajmuje się zależnościami pomiędzy drobnoustrojami a środowiskiem ich występowania oraz zależnościami pomiędzy samymi mikroorganizmami. Zespoły mikroorganizmów zanieczyszczające dane środowisko oraz ich otoczenie tworzą ekosystem. Składnikiem żywym ekosystemu jest biocenoza mikroorganizmów.

W obrębie każdej biocenozy wyróżniamy:

• Gatunki rodzinne (autochtoniczne)

• Formy przejściowe (allochtoniczne), pochodzące z innych środowisk. Utrzymują się w biocenozie tylko przez pewien czas (zazwyczaj w formie nieaktywnej, bez objawów wzrostu) i jako obce po jakimś czasie zostaną wyeliminowane.

Tworzenie biocenozy rozpoczyna się od tzw. gatunków pionierskich i kończy na zespole stabilnym, charakterystycznym dla danego środowiska (biocenoza klimaksowi).

SUKCESJA EKOLOGICZNA

Sukcesja pierwotna - zachodzi w środowiskach wyjściowo jałowych. Rodzaj gatunków pionierskich zależy od składu chemicznego i warunków fizyko chemicznych środowiska.

Środowiska ubogie (czysta woda) są zasiedlane przez mikroorganizmy autotroficzne, o małych wymaganiach pokarmowych (glony, sinice, niektóre bakterie fotosyntezy anoksygenowej), są to tzw. producenci. Po śmierci wzbogacają środowisko w związki pokarmowe i umożliwiają rozmów mikroorganizmów heterotroficznych. Środowiska bogate odżywczo (produkty lub surowce spożywcze) są zasiedlane przez mikroorganizmy heterotroficzne (bakterie, grzyby). Im środowisko jest bardziej różnorodne chemicznie, tym bogatszy i różnorodny jest zespół mikroorganizmów. Po wyczerpaniu składników pokarmowych następuje rozwój autotrofów.

Sukcesja wtórna - rozwój mikroorganizmów z pominięciem typowej fazy pionierskiej. Sukcesja wtórna występuje w środowiskach, w których zakłócono (zanieczyszczono) część naturalnie istniejącego zespołu mikroorganizmów (np. pasteryzacja, wysuszenie, zakwaszenie). Pozostałe mikroorganizmy (odporne na zastosowany czynnik środowiskowy) staja się mikroflora dominującą, ale nietypową dla danego produktu/surowca. Przebieg psucia takich produktów/surowców jest niespecyficzny, a różnorodność gatunkowa mikroorganizmów - niewielka.

Zespół mikroorganizmów w biocenozie zależy:

Biotyczne Abiotyczne

- rodzaje mikroorganizmów - rodzaj substancji pokarmowych

- początkowa liczba (No) - temperatura

- metabolizm (wydajność wzrostu) - pH

- szybkość wzrostu - aktywność wody

- zależność od innych gatunków - obecność substancji toksycznych

Charakterystyczny dla danego środowiska zespół mikroorganizmów.

Prawa ekologiczne

Środowiska bogate odżywczo (np. surowce i produkty spożywcze, przewód pokarmowy) są zasiedlane przez mikroorganizmy heterotroficzne. Środowiska ubogie (czysta woda pitna, wody mineralne) są zasiedlane przez mikroorganizmy autotroficzne. Im środowisko jest bardziej różnorodne chemicznie tym bogatszy i bardziej różnorodny jest zespół mikroorganizmów. Dominują mikroorganizmy o szybkim wzroście, przystosowane do metabolizowania różnych składników pokarmowych oraz odporne na warunki fizykochemiczne środowiska. Skład biocenozy zależy również od interakcji pomiędzy drobnoustrojami.

Systemy współzależności pomiędzy mikroorganizmami

Współzależność	Wpływ na wzrost i przeżycie populacji A i B
		A	B
Oddziaływanie bezpośrednie
Symbioza	+	+
Pasożytnictwo	+	0, -
Drapieżnictwo	+	-
Oddziaływanie pośrednie (poprzez środowisko)
Neutralizm	0	0
Komensalizm	+	0
Protokooperacja	+	+
Konkurencja	-	-
Amensalizm	-	0

+ wskaźnik wzrostu populacji zwiększa się

- wskaźnik wzrostu populacji zmniejsza się

0 wskaźnik wzrostu populacji pozostaje bez zmian

Oddziaływanie bezpośrednie (konieczny bezpośredni kontakt partnerów)

SYMBIOZA

Współzależność w wyniku której obydwaj partnerzy odnoszą korzyść, np. porosty, współzależności między mikroorganizmami i organizmami wyższymi (rośliny, człowiek, zwierzęta).

Oddziaływania symbiontów:

• Symbioza składników pokarmowych

• Przekształcanie przez mikrosymbionty substancji nieprzyswajalnych dla organizmu wyższego (gospodarza)

• Dostarczanie substancji wzrostowych

• Wykorzystanie i w ten sposób usuwanie substancji szkodliwych (toksycznych dla partnera)

• Ochrona przed szkodliwymi warunkami środowiska

• Zmiany parametrów fizycznych środowiska

Symbioza między mikroorganizmami:

• Zespoły porostów: glony lub sinice z grzybami

• Zespoły glonów i bakterii (endosymbioza)

• Zespoły pierwotniaków i bakterii (endosymbioza)

Rysunki pierwotniak z endosymbiontem o aktywności celulolitycznej (z przewodu pokarmowego termitów)

Formowanie biofilmu

Faza I: przyleganie (adhezja) komórek do powierzchni stałej

Faza II: kolonizacja (międzykomórkowa komunikacja, wzrost i tworzenie polisacharydów)

Faza III: dojrzewanie (silny wzrost bakterii i synteza polisacharydów)

Główne organizmy tworzące biofilny: Pseudomonas, Escherichia, Proteus, Bacillus, Legionella, Staphylococcus, Vibrio, Listeria

Legionella - Legionella pneumophila gram (-) pałeczki, ruchliwe, o wymiarach 0,6 x 2µm. W szpitalach największe zagrożenie stwarza płukany w niesterylnej wodzie sprzęt medyczny.

• Mikroorganizmy i rośliny

• Mikroorganizmy i zwierzęta przeżuwające

„Komora fermentacyjna” u krowy (ok. 100 - 180 l) składa się z 3 części: żwacz, czepie, księgi.

Symbioza w żwaczu

Rozkład celulozy: Fibroblaster, Butyrivibrio, Ruminococcus, Clostridium.

Rozkład skrobi: Prevotella, Ruminobacter, Selenomonas, Succinomonas, Streptococcus

57,5 g glukoza 65 kwas octowy +20 kwas propionowy + 15 kwas masłowy + 60 CO₂ + 35 CH₄ + 25 H₂O

SYMBIOZA MIĘDZY MIKRO - I ORGANIZMAMI WYŻSZYMI

Mikroorganizmy i człowiek

• Mikroflora skóry

• dróg rodnych

• przewodu pokarmowego

Łącznie człowiek jest zasiedlony przez 10¹⁴ komórek różnych mikroorganizmów, należących do ok. 1200 gatunków (liczba komórek, z których człowiek jest zbudowany wynosi 10¹³).

Mikroflora skóry i błon śluzowych

• przejściowa (z surowców, powietrza, wody, gleby)

• stała (związana ze stanami chorobowymi - najczęściej gronkowce chorobotwórcze i Propionibacterium acnes)

Mikroflora przewodu pokarmowego (zależnie od odcinka od 10 do 10¹²/g)

W jelicie grubym znajduje się 10¹⁰ - 10¹² mikroorganizmów/g - co stanowi do 30 - 40% masy kału.

CZŁOWIEK I MIKROORGANIZMY - SKÓRA

Bakterie (do 180 gatunków): Propioribacterium, Corynebacyerium, Staphylococcus, Streptococcus (łącznie około 54%), Acinobacter, Enterobacter, Klebsiella, Micrococcus, Proteus, Pseudomonas

Drożdże: Mallassezia, Pityrosporum

1. Rozkład obumarłych komórek skóry, składników wydzielin (pot, śluz, tłuszcz)

2. Fermentacja

3. Obniżenie pH = 4 - 6

4. Ochrona przed rozwojem patogenów

CZŁOWIEK I MIKROORGANIZMY - UKŁAD MOCZOWO PŁUCIOWY

Bakterie: Escherichia, Klobsiella, Proteus, Neisseria, Lactobacillus, Corynebacterium, Staphylococcus, Prevotella, Clostridium, Peptostreptococcus, Ureaplasma, Mycoplasma, Mycobacterium, Streptococcus

Drożdże: Candida, Torulopsis

1. Rozkład obumarłych komórek nabłonka, składników wydzielin (śluz)

2. Fermentacja

3. Obniżenie pH = 5 - 5,5

4. Hamowanie rozwoju patogenów

Czas pasażu pokarmu (jama ustna - odbytnica) trwa 55 - 72 godziny, z których 4 - 6 godzin zajmuje pasaż z jamy ustnej do jelita grubego. Czas pasażu w jelicie grubym 54 - 56 godzin.

JELITO GRUBE

Liczy około 10¹⁴ komórek mikroorganizmów i stanowi jeden z najgęstszych i najbogatszych gatunkowo ekosystemów na ziemi. W jelitach człowieka wykryto przedstawicieli wszystkich trzech domen życia: Archeony, Bakterie, Eycaria. Dominują bakterie. W skład mikroflory jelitowej wchodzić może nawet 120 gatunków, przy czym około 400 gatunków występuje u wszystkich ludzi. Gatunki bakterii jelitowych należą do 8 z 25 znanych działów (Phylum), głównie to Firmicudes (gram + o niskiej zawartości G + C)- 46 - 58%, Bacterioitetes i Actinobacteria (o wysokiej zawartości G + C) - 8 - 17% oraz do gram (-) Proteobacteria - 10 - 30%. Mikroflora występuje zarówno w postaci biofilmu na nabłonku jelitowym jak i w postaci wolnych komórek. Skład mikroflory jelitowej zależy od wielu czynników biotycznych i abiotycznych.

Przewód pokarmowy zasiedla ponadto kilkaset różnych gatunków specyficznych dla poszczególnych ludzi oraz bakterii wprowadzonych wraz z pokarmem.

KORZYSTN AFUNKCJA MIKROFLORY JELITOWEJ

• Udział w trawieniu resztek pokarmowych, które dostały się do jelita grubego.

• Produkty fermentacji (głownie SCFA) obniżają pH jelita, stymulują rozwój nabłonka jelitowego (kwas mlekowy), hepatocytów (kwas propionowy), tkanek obwodowych (kwas octowy), regulują gospodarkę mineralną, pobudzając absorpcję z jelita grubego jonów wapnia, magnezu i żelaza.

• Bariera przed kolonizacją przez szkodliwe (patogeny i toksyno twórcze) mikroorganizmu (konkurencja o przestrzeń życiową, substancje odżywcze, tworzenie niekorzystnego środowiska fizjologicznego, wytwarzanie bakteriocyn).

• Obniżenie pH treści jelitowej, głównie bakterie fermentacji mlekowe.

• Synteza witamin z grupy B (B12 i K).

• Stymulacja układu odpornościowego człowieka.

---