plik


ÿþWyznaczanie parametrów kinetycznych peroksydazy (POX) z korzenia chrzanu Roztwory wyj[ciowe: bufor (fosforanowy 100 mM (wzgl. KH2PO4, dopr. KOH); pH=6.0) roztwór H2O2 3% (woda utleniona farmaceutyczna) roztwór pirogallolu w buforze, 0.5% roztwór POX w buforze, 0.1* mg/ml Przygotowa roztwory robocze: roztwór POX rozcieDczy 5x (lub w sposób podany przez prowadzcego*) szereg rozcieDczeD H2O2 w buforze: 500, 250, 125 i 62.5 ppm Wykonanie: - W kuwecie spektrofotometrycznej na 1 ml umie[ci kolejno: 100 ul buforu 100 ul roztworu pirogallolu 5 ul roztworu POX 700 ul wody; po dodaniu wody roztwór kilkakrotnie wcign i wypu[ci z koDcówki pipety. - Kilkakrotnie stukn kuwet o blat stoBu (nie rozbi!), aby oderwaBy si ew. pcherzyki powietrza - Umie[ci kuwet w spektrofotometrze ustawionym uprzednio na lð=420 nm - Przygotowa stoper/sekundnik, nabra do pipety automatycznej 100 ul roztworu H2O2 o st|eniu, dla którego chcemy wykona pomiary - Wyzerowa spektrofotometr - Doda roztwór H2O2 do kuwety tak aby wymiesza roztwory w kuwecie; jednocze[nie uruchami pomiar czasu - Odczytywa warto[ci absorbancji w 10, 20, 30, 40 i 60 s trwania reakcji. Dla ka|dego st|enia substratu (i dla st|enia 0 - bufor zamiast roztworu H2O2) wykona po 3 pomiary. Molowy wspóBczynnik absorbancji powstajcej substancji barwnej eð=2640 AU M-1 cm-1. Obliczenia KM i Vmax przeprowadzi jak w przypadku inwertazy. * Uwaga: st|enie POX w próbce musi by takie, aby po 60 s reakcji absorbancja nie przekraczaBa 0.3. [AW] 4 - 4

Wyszukiwarka