71213

Metody szacowania stężeń DNA za pomocą płytek agaroz/owych, jakie są jej wady i Tjalety. Czy istnieje alternatywa tej metody?

Metoda jest przydatna tylko do szacowania niskich stężeń DNA np.. w przypadku izolacji z żelu agarozowego. Do określenia ilości DNA w badanej próbce oraz stopnia jego czystości stosuje się metody spektrofotoinetryczne.

Opis metody:

1 Na szalki Petreigo wylać podgrzany roztwór agarozy w buforze TE, zawierający bromek etydyny(st. końcowe lug/ml)

2. Przygotować standardy DNA (zakres standardów powinien obejmować stężenia DNA od 5-lOOng/m), DNA faga lambda w roztworach o znanym stężeniu.

3. Zaznaczyć punkty nanoszenia próbek badanych oraz standardów.

4. Nakladać po 0,5ul

5.    Pozostawić płytki do wchłonięcia próbek przez agaiozę.

6.    Stężenia DNA w badanych próbka określa się na transiluminatorze (UV 254nm), porównując stopień fluorescencji względem standardów.

Alternatywą tej metody jest pomiar absorpcji światła UV. Do pomiaru spektrofotometrycznego preparaty muszą być z reguły rozcieńczone 100x H20 lub buforem TE. Do kalibracji spektrofotometru używa się tego samego roztworu co do rozcieńczeń preparatów. Po kalibracji odczytuje się wartość absorpcji punktowo przy 260, 280 i 320nm lub wykonuje się widmo w zakresie 200-350nm. Absorbancja przy 260nm jest równa 1 dla dwuniciowego DNA o stężeniu 50ug/ml, dla jednomciowego DNA o stężeniu 33ug/ml i RNA o stężeniu 40ug/ml Różnice w absorbancji są wynikiem złożoności struktury.

Stężenie dwuniciowego DNA oblicza się wg wzoru:

C(ug/ml)=(A260-A320) x 50 x rozcieńczenie Stężenie jednoniciowego DNA oblicza się:

C(ug/ml)=(A260-A320) x 33 x rozcieńczeme Na ustalenie stężenia DNA maja wpływ tez inne substancje dlatego zaleca się wykonanie pomiaru przy kilku długościach fali. ( 230nm-EDTA. etanol, polisacharydy; 260nm- DNA. RNA: 270- etanol; 280nm-bialka; 320mn-drobiny komo\órkowe). Stosiuiek wartości 260/280 świadczy o zanieczyszczeniu preparatów kw. Nukleinowych białkami. Wartość wspólczyimika między 1,8-2,0 oznacza, że preparaty są wystarczająco oczyszczone.

W odróżnieniu od pomiarów światła UV poprzez frakcjonowanie preparatów kwasów nukleinowych w żelu agarozowym można określić również ich jakość.