84555

1.    Cel ćwiczenia

Rozdział białek na kolumnie wypełnionej żelem Sephadex G-75.

Wyznaczenie dostępnych współczynników podziału K_avdla badanych białek. Wykreślenie profilu elucji dla przeprowadzonego procesu chromatografii żelowej. Przygotowanie próbek do elektroforezy żelowej.

2.    Wstęp teoretyczny

Chromatografia żelowa jest jedną z form cieczowej chromatografii, w której substancje są rozdzielane w zależności od wielkości ich cząsteczek. Żel zbudowany jest z porowatych granulek. Do wnętrza każdej granulki może swobodnie wchodzić rozpuszczalnik. Podczas przechodzenia cząsteczek substancji rozpuszczonych przez kolumnę mniejsze cząsteczki dyfundują do wnętrza porowatych granulek żelu, a duże cząsteczki w ogóle nie wnikają do wnętrza granulek i spływają z frontem rozpuszczalnika w dół kolumny. W efekcie małe cząstki będą zatrzymywane na kolumnie w stopniu zależnym od ich zdolności dyfuzji do wnętrza żelu. Zbierane frakcje badane są w celu stwierdzenia kolejności wymywania poszczególnych składników z kolumny.

Wielkością charakteryzującą cząsteczkę w chromatografii żelowej jest objętość elucji. Jest to objętość rozpuszczalnika niezbędna do przeniesienia danej substancji przez kolumnę wypełnioną żelem aż do pojawienia się jej maksymalnego stężenia w eluacie opuszczającym kolumnę.

3.    Materiały

>    Odczynniki

^ bufor (20 mM TRIS-HCI, 0.1 M NaCI) o pH 7.5 - eluent S próbka - roztwór Blue Dextranu (stężenie końcowe w próbce - 2 mg/ml), roztwór mieszaniny białek owoalbuminy i lizozymu (5 mg/ml) s złoże Sephadex G-75 zawieszone w buforze ( 20 mM TRIS-HCI, 0.1 M NaCI) o pH 7.5

^ 2x stężony bufor do nanoszenia próbek na PAGE (124 mM Tris-HCI, 4% SDS (w/v), 10% (v/v) p-merkaptoetanol, 20% (v/v) glicerol, 0.005 (w/v) błękit bromofenolowy, pH 6.8)

>    Szkło i aparatura

S kolumna chromatograficzna S probówki pomiarowe do spektrofotometru Specol S 2 cylindry miarowe o pojemności 5 ml S Cylinder miarowy o pojemności 10 ml S Zlewki i kolby o pojemności 250 i 500 ml s Bagietka S Tryskawka

S Pipety automatyczne oraz końcówki S Specol

S Spektrofotometr UV

4.    Przebieg ćwiczenia

a. Wyznaczanie objętości zerowej kolumny

• Przygotowaliśmy probówki szklane, do których zbieraliśmy frakcje z kolumny.