B i o c h e m i a {Y W I E N I E C Z AO W I E K A w i c z e n i e 1
w i c z e n i e 1
T e m a t : W AA ZC I W O ZC I F I Z Y K O - C H E M I C Z N E A M I N O K W A S W .
C z [ t e o r e t y c z n a
A m i n o k w a s y s t o z w i z k i o r g a n i c z n e z a w i e r a j c e g r u p k a r b o k s y l o w i a m i n o w ( z w y k l e w
p o Bo |e n i u w s t o s u n k u d o g r u p y k w a s o w e j ) . O b o k a m i n o k w a s w a l i f a t y c z n y c h s i t a k i e k t r e
z a w i e r a j p i e r [c i e D a r o m a t y c z n y , h e t e r o c y k l i c z n y l u b d o d a t k o w e g r u p y n p . - O H ,
- S H i t p . Z u w a g i n a o b e c n o [ d w c h p o d s t a w o w y c h g r u p z d o l n y c h d o d y s o c j a c j i e l e k t r o l i t y c z n e j ,
a m i n o k w a s y m a j c h a r a k t e r j o n u o b o j n a c z e g o , r e a g u j c z a r w n o z k w a s a m i j a k i z z a s a d a m i ( t w o -
r z c s o l e ) . Z u w a g i n a o b e c n o [ w g l a a s y m e t r y c z n e g o z w i z k i t e ( z w y j t k i e m g l i c y n y ) t w o r z
d w a i z o m e r y p r z e s t r z e n n e , z k t r y c h j e d y n i e f o r m a L w y s t p u j e n a t u r a l n i e . S z c z e g By d o t y c z c e
b u d o w y i w Ba [c i w o [c i a m i n o k w a s w n a l e |y p r z y s w o i w o p a r c i u o d o s t p n e p o d r c z n i k i b i o c h e -
m i i .
K l a s y f i k a c j a a m i n o k w a s w
A m i n o k w a s y d z i e l i s i n a g r u p y s y s t e m a t y c z n e w z a l e |n o [c i o d r |n y c h k r y t e r i w . Z a n a j -
w a |n i e j s z y u w a |a s i p o d z i a B a m i n o k w a s w p o d w z g l d e m i c h b u d o w y c h e m i c z n e j . I n n e p o d z i a By
t o w y s t p o w a n i e l u b b r a k a m i n o k w a s w w b i a Bk a c h ( a m i n o k w a s y b i a Bk o w e i n i e b i a Bk o w e ) i w r e s z -
c i e z d o l n o [ o r g a n i z m w z w i e r z c y c h i c z Bo w i e k a d o s y n t e z y p o s z c z e g l n y c h a m i n o k w a s w ( a m i -
n o k w a s y e n d o g e n n e i e g z o g e n n e ) . S z c z e g By d o t y c z c e k l a s y f i k a c j i a m i n o k w a s w n a l e |y u z u p e B-
n i z p o d r c z n i k a .
O g l n e r e a k c j e a m i n o k w a s w
1 . E S T R Y F I K A C J A G R U P Y K A R B O K S Y L O W E J A M I N O K W A S U .
E s t r y f i k a c j a g r u p y k a r b o k s y l o w e j a m i n o k w a s u z g r u p h y d r o k s y l o w a l k o h o l u z a c h o d z i
z g o d n i e z r e a k c j :
O
O
C O H
C O - C H 2 - C H
3
N
H
C H N
2 H
+ H O - C H - C H C H
2
2 3
+
H 2 O
R
R
a m i n o k w a s a l k o h o l e s t e r
E s t r y t e w p r z e c i w i e Ds t w i e d o a m i n o k w a s w s l o t n e a r e a k c j a i c h p o w s t a w a n i a b y w a w y k o -
r z y s t y w a n a w c h r o m a t o g r a f i i g a z o w e j , z a p o m o c k t r e j r o z d z i e l a s i w s p o s b z a u t o m a t y z o w a n y
s u b s t a n c j e l o t n e .
2 . T W O R Z E N I E S I W I Z A N I A P E P T Y D O W E G O .
W i z a n i e p e p t y d o w e t w o r z y s i w r e a k c j i g r u p y k a r b o k s y l o w e j j e d n e g o a m i n o k w a s u z g r u p
a m i n o w d r u g i e g o a m i n o k w a s u z g o d n i e z r e a k c j :
+
+ H N - C H - C O O _ + H N - C H - C O O _
+ H N - C H - _
_
3 3
C O - N H - C H - C O O
|
H 2 O
| 3
|
|
R 2
R 1
R 1
R
2
R e a k c j a t a m a s z c z e g l n i e w a |n e z n a c z e n i e g d y | w t e n s p o s b t w o r z s i p e p t y d y i b i a Bk a .
1
U n i w e r s y t e t R o l n i c z y w K r a k o w i e K a t e d r a B i o t e c h n o l o g i i {y w n o [c i
B i o c h e m i a {Y W I E N I E C Z AO W I E K A w i c z e n i e 1
C z [ p r a k t y c z n a
A ) R E A K C J E C H A R A K T E R Y S T Y C Z N E A M I N O K W A S W
1 . R E A K C J A Z N I N H Y D R Y N
C h a r a k t e r y s t y c z n a d l a - a m i n o k w a s w p o n i e w a | p r z e b i e g a w w c z a s , g d y w p o Bo |e n i u w
s t o s u n k u d o g r u p y k a r b o k s y l o w e j z n a j d u j e s i g r u p a a m i n o w a . P r z e b i e g a o n a w d w c h e t a p a c h :
O
O
C
I
O H
C O O H
H
C
O
C +
H N - C - H
C
2 + C - H + C O 2 + N H 3
O H
R C
C
O H
R
O
O
n i n h y d r y n a a m i n o k w a s n i n h y d r y n a z r e d u k o w a n a
_
O
O
I I
C
C
n i n h y d r y n a
+ n i n h y d r y n a + N H 3
C N
C + 3 H 2 O
z r e d u k o w a n a
C C
O
O
f i o l e t o w o - n i e b i e s k i k o m p l e k s b a r w n y
W y d z i e l a j c y s i w c z a s i e r e a k c j i C O 2 m o |n a m i e r z y m a n o m e t r y c z n i e w a p a r a c i e v a n S l y k -
e ' a , z a [ n a t |e n i e b a r w y k o m p l e k s u m o |n a m i e r z y k o l o r y m e t r y c z n i e . R e a k c j a t a d a j e w i c p o d -
s t a w y d o i l o [c i o w e g o o z n a c z e n i a b a d a n y c h a m i n o k w a s w , a t a k |e j e s t p o d s t a w o w a n a l i z j a k o -
[c i o w .
W y k o n a n i e :
1 m l b a d a n e g o a m i n o k w a s u i 0 , 5 m l n i n h y d r y n y w y m i e s z a w p r o b w c e i o g r z e w a n a d p a l -
n i k i e m d o w r z e n i a . P o c h w i l i p o j a w i a s i f i o l e t o w e z a b a r w i e n i e , a w p r z y p a d k u p r o l i n y i h y d r o k s y -
p r o l i n y z a b a r w i e n i e | Bt e .
2 . R E A K C J A N A G R U P T I O L O W S H
W [r o d o w i s k u s i l n i e z a s a d o w y m z a m i n o k w a s w s i a r k o w y c h t a k i c h j a k c y s t e i n a o d s z c z e p i a
s i g r u p a - S H w p o s t a c i s i a r c z k w . S i a r c z k i w o b e c n o [c i s o l i o Bo w i u t w o r z c z a r n y o s a d s i a r c z k u
o Bo w i u .
a /
C H _ S H
C H 2 _ O H
2
| |
_ _
C H N H 2 N a O H C H N H
+ N a 2 S
+ +
H 2 O
2 2
| |
C O O H C O O H
b /
N a 2 S + P b ( C H 3 C O O )
P b S + 2 C H 3
C O O N a
2
c z a r n y o s a d
W y k o n a n i e :
1 m l 0 , 0 5 % c y s t y n y l u b c y s t e i n y i 1 0 k r o p l i 2 0 % N a O H o g r z e w a w p r o b w c e n a d p a l n i k i e m
d o w r z e n i a . N a s t p n i e d o d a 3 - 4 k r o p l e n a s y c o n e g o r o z t w o r u o c t a n u o Bo w i u i w d a l s z y m c i g u
p o d g r z e w a ( d o o d p a r o w a n i a p o Bo w y o b j t o [c i p By n u ) . O b s e r w u j e s i w y t r c a n i e c z a r n e g o s i a r c z k u
o Bo w i u , z k t r e g o p o d o d a n i u k i l k u k r o p l i s t |o n e g o H C l w y d z i e l a s i s i a r k o w o d r .
2
U n i w e r s y t e t R o l n i c z y w K r a k o w i e K a t e d r a B i o t e c h n o l o g i i {y w n o [c i
B i o c h e m i a {Y W I E N I E C Z AO W I E K A w i c z e n i e 1
3 . R E A K C J A N A W Y K R Y C I E P I E R ZC I E N I A I N D O L U ( P R B A A D A M K I E W I C Z A ) .
Z w i z k i z a w i e r a j c e p i e r [c i e D i n d o l u m i d z y i n n y m i t r y p t o f a n w [r o d o w i s k u m o c n o k w a s o -
w y m , w o b e c n o [c i a l d e h y d w d a j b a r w n e p r o d u k t y k o n d e n s a c j i . W p r b i e A d a m k i e w i c z a s t o s u j e
s i k w a s g l i o k s a l o w y C H O C O O H .
C O O H
C O O H
C O O H
C H N H 2
C H N H 2 C H N H 2
C H 2
C H 2 C H 2
O
2
+ C - H
+ H 2
O
H
C O O H
N
C
N
N
H
C O O H
H
H
k o m p l e k s b a r w y f i o l e t o w e j
W y k o n a n i e :
D o 1 m l r o z t w o r u t r y p t o f a n u d o d a 0 , 5 m l k w a s u g l i o k s a l o w e g o i w y m i e s z a d o k Ba d n i e w
p r o b w c e , n a s t p n i e p By n p o d w a r s t w i 1 m l s t |o n e g o k w a s u s i a r k o w e g o ( n i e m i e s z a ! ) , w s t a w i
d o w r z c e j Ba zn i w o d n e j n a 2 m i n u t y . N a g r a n i c y p By n w p o j a w i a s i f i o l e t o w y p i e r [c i e D.
4 . W Y K R Y C I E P I E R ZC I E N I A I M I D A Z O L O W E G O W R E A K C J I Z K W A S E M
P A R A D W U A Z O B E N Z E N O - S U L F O N O W Y M .
P i e r [c i e D i m i d a z o l o w y u l e g a r e a k c j i z k w a s e m p a r a d w u a z o b e n z e n o s u l f o n o w y m z w y t w o r z e -
n i e m k o m p l e k s u o b a r w i e p o m a r a Dc z o w o - | Bt e j . R e a k c j t d a j e h i s t y d y n a .
W y k o n a n i e :
S p o r z d z i k w a s p - d w u a z o b e n z e n o s u l f o n o w y p r z e z z m i e s z a n i e 1 m l 0 , 5 % k w a s u s u l f a n i l o -
w e g o i 1 m l 0 , 5 % N a N O 2 . R o z t w r z o b o j t n i k r y s t a l i c z n y m N a 2 C O 3 d o d a j c d o p r o b w k i w g l a -
n u t a k d u |o d o p k i r o z t w r s i b u r z y . N a s t p n i e d o d a h i s t y d y n y i o b s e r w o w a t w o r z e n i e s i b a r -
w y p o m a r a Dc z o w o - | Bt e j .
3
U n i w e r s y t e t R o l n i c z y w K r a k o w i e K a t e d r a B i o t e c h n o l o g i i {y w n o [c i
B i o c h e m i a {Y W I E N I E C Z AO W I E K A w i c z e n i e 1
5 . R E A K C J A N A P I E R ZC I E C A R O M A T Y C Z N Y . P R B A K S A N T O P R O T E I N O W A .
Z w i z k i a r o m a t y c z n e o g r z e w a n e z k w a s e m a z o t o w y m u l e g a j n i t r o w a n i u z u t w o r z e n i e m
b a r w y | Bt e j . P o c h o d n e n i t r o w e w [r o d o w i s k u a l k a l i c z n y m p r z e c h o d z w s o l e s o d o w e o b a r w i e
p o m a r a Dc z o w e j .
O 2 N
H 2 S O 4
H O C H 2 C H C O O H H N O 3
+ 2 H O C H 2 C H C O O H
H 2 O
2
N H 2
N H 2
O 2 N
b a r w a | Bt a
W y k o n a n i e :
2 m l t r y p t o f a n u l u b t y r o z y n y z a l a 2 m l s t |o n e g o H N O 3 i p o d g r z e w a k i l k a m i n u t n a Ba zn i
w o d n e j . R o z t w r p r z y b i e r a b a r w | Bt . P o o z i b i e n i u z a l k a l i z o w a 2 0 % N a O H . W m i a r d o d a w a -
n i a Bu g u r o z w i j a s i b a r w a p o m a r a Dc z o w a .
B ) W Y K A Z A N I E A M F O T E R Y C Z N Y C H W AA ZC I W O ZC I A M I N O K W A S W
C h a r a k t e r a m f o t e r y c z n y a m i n o k w a s w u j m u j e g r a f i c z n i e k r z y w a m i a r e c z k o w a n i a w o d n y c h
r o z t w o r w a m i n o k w a s w m o c n y m i k w a s a m i i z a s a d a m i . P r z e d s t a w i a o n a z a l e |n o [ w a r t o [c i p H
m i a r e c z k o w a n e g o r o z t w o r u a m i n o k w a s u o d i l o [c i d o d a w a n y c h m o l i k w a s u l u b z a s a d y . M i a r e c z -
k o w a n i e r o z t w o r u a m i n o k w a s u p o Bc z o n e z r w n o c z e s n y m p o m i a r e m p H r o z t w o r u p o z w a l a n a d o -
[w i a d c z a l n e w y z n a c z e n i e k r z y w e j d y s o c j a c j i a m i n o k w a s u i w a r t o [c i p K j e g o g r u p f u n k c y j n y c h .
W y k o n a n i e :
W d w c h z l e w k a c h n a 1 0 0 m l p r z y g o t o w a p o 1 0 m l 0 , 1 M r o z t w o r u g l i c y n y ( d o d a o k . 3 0
m l w o d y , b y m o |n a b y Bo z a n u r z y e l e k t r o d ) . R o z t w r w j e d n e j z l e w c e m i a r e c z k o w a p o t e n c j o m e -
t r y c z n i e H C l , a w d r u g i e j z l e w c e m i a r e c z k o w a N a O H .
M i a r e c z k o w a n i e k w a s e m : z m i e r z y w y j [c i o w e p H r o z t w o r u g l i c y n y i s t o p n i o w o d o d a w a p o
0 , 5 m l 0 , 1 M H C l , m i e r z c z a k a |d y m r a z e m p H . P o d o d a n i u 3 m l k w a s u , z w i k s z y p o r c j d o d a -
w a n e g o k w a s u d o 1 m l . P o m i a r z a k o Dc z y p o d o d a n i u 1 2 m l k w a s u .
M i a r e c z k o w a n i e Bu g i e m : z m i e r z y w y j [c i o w e p H r o z t w o r u g l i c y n y i s t o p n i o w o d o d a w a p o
0 , 5 m l 0 , 1 M N a O H , m i e r z c z a k a |d y m r a z e m p H . P o d o d a n i u 3 m l Bu g u , z w i k s z y p o r c j d o d a -
w a n e g o Bu g u d o 1 m l . P o m i a r z a k o Dc z y p o d o d a n i u 1 2 m l Bu g u .
P o m i a r u p H d o k o n y w a n a p H - m e t r z e . W y k r e [l i k r z y w p o t e n c j o m e t r y c z n e g o m i a r e c z k o -
w a n i a n a n o s z c n a o [ o d c i t y c h i l o [ m l k w a s u i Bu g u , a n a o [ r z d n y c h w a r t o [c i p H . Z w y k r e s u
o d c z y t a w a r t o [c i p K d l a k w a s u i Bu g u o r a z w a r t o [ p I .
C . R O Z D Z I A A A M I N O K W A S W M E T O D
C H R O M A T O G R A F I I B I B U AO W E J R O Z D Z I E L C Z E J
C h r o m a t o g r a f i a t o t e c h n i k a , w k t r e j u n o s z o n e p r z e z f a z r u c h o m s u b s t a n c j e r o z d z i e l a j s i
d z i k i r |n i c o m w i c h w Ba [c i w o [c i a c h f i z y k o - c h e m i c z n y m ( w i e l k o [ c z s t e c z e k , h y d r o f o b o w o [,
p o w i n o w a c t w o i t p . ) o d d z i a Bu j c z f a z s t a c j o n a r n . Z e w z g l d u n a s i By f i z y c z n e , k t r e o d g r y w a j
r o l w p r o c e s i e r o z d z i a Bu o r a z s t a n s k u p i e n i a f a z y s t a c j o n a r n e j w y o d r b n i a s i : c h r o m a t o g r a f i
a d s o r p c y j n i p o d z i a Bo w . R o z d z i a B s k Ba d n i k w w c h r o m a t o g r a f i i a d s o r p c y j n e j ( c h r o m a t o g r a f i a
w u k Ba d z i e c i e c z - c i a Bo s t a Be ) u w a r u n k o w a n y j e s t g B w n i e r |n i c a m i w p o Bo |e n i u i c h a r a k t e r z e p o -
l a r n y c h p o d s t a w n i k w w c z s t e c z k a c h a d s o r b a t u ( s u b s t a n c j i z a t r z y m a n e j n a p o w i e r z c h n i a d s o r b e n -
t u ) ; w p o d z i a Bo w e j ( c h r o m a t o g r a f i a w u k Ba d z i e c i e c z - c i e c z ) o d m i e n n r o z p u s z c z a l n o [c i s o l u t u
( s u b s t a n c j i r o z p u s z c z o n e j w u k Ba d z i e r o z w i j a j c y m ) w o b u f a z a c h c i e k By c h .
4
U n i w e r s y t e t R o l n i c z y w K r a k o w i e K a t e d r a B i o t e c h n o l o g i i {y w n o [c i
B i o c h e m i a {Y W I E N I E C Z AO W I E K A w i c z e n i e 1
T e c h n i k i c h r o m a t o g r a f i c z n e m o |n a p o d z i e l i b a r d z i e j s z c z e g Bo w o i w y r |n i d o d a t k o w o :
c h r o m a t o g r a f i |e l o w ( s i t a m o l e k u l a r n e g o ) , j o n o w y m i e n n , p o w i n o w a c t w a , o d d z i a By w a D h y d r o -
f o b o w y c h . Z k o l e i z e w z g l d u n a t e c h n i k p r a c y w y r |n i a s i d w a r o d z a j e c h r o m a t o g r a f i i : k o l u m -
n o w i p l a n a r n , d o t e j d r u g i e j z a l i c z a s i c h r o m a t o g r a f i b i b u Bo w o r a z c i e n k o w a r s t w o w . W
c h r o m a t o g r a f i i b i b u Bo w e j n o [n i k i e m f a z y s t a c j o n a r n e j ( n a j c z [c i e j p o l a r n e j ) j e s t o d p o w i e d n i o s p r e -
p a r o w a n a b i b u Ba f i l t r a c y j n a . Z u w a g i n a k i e r u n e k m i g r a c j i f a z y r u c h o m e j w b i b u l e w y r |n i a s i
c h r o m a t o g r a f i j e d n o w y m i a r o w i d w u w y m i a r o w , a z e w z g l d u n a k s z t a Bt b i b u By c h r o m a t o g r a -
f i a r k u s z o w , p a s k o w o r a z k r |k o w .
W y k o n a n i e :
Z b i b u By W h a t m a n 1 w y c i p a s e k o s z e r o k o [c i 1 5 c m i d Bu g o [c i 2 2 c m . W o d l e g Bo [c i 2 c m
o d d o Bu z a z n a c z y m i k k i m o B w k i e m l i n i s t a r t o w i n a n i e [ m i k r o p i p e t m i e s z a n i n b a d a n y c h
a m i n o k w a s w o r a z w z o r c e . P o w y s u s z e n i u p l a m z a w i e s i p a s e k n a p r c i k u s z k l a n y m i u m i e [c i w
k o m o r z e z u k Ba d e m r o z p u s z c z a l n i k w . R o z w i j a m i n i m u m 2 g o d z . P o u p By w i e t e g o c z a s u c h r o m a -
t o g r a m w y j z k o m o r y , w y s u s z y w s u s z a r c e w t e m p . 1 0 0 o C . Z w i l |y p a s e k r o z t w o r e m n i n h y d r y -
n y w a c e t o n i e l u b i z a t y n y w a c e t o n i e i p o n o w n i e w y s u s z y . N a p o d s t a w i e r |n i c w s z y b k o [c i w -
d r w k i z i d e n t y f i k o w a b a d a n e a m i n o k w a s y .
Z a Bc z n i k :
O s t a t n i e z m i a n y : 1 3 . 0 2 . 2 0 1 3
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U n i w e r s y t e t R o l n i c z y w K r a k o w i e K a t e d r a B i o t e c h n o l o g i i {y w n o [c i
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