2808184943

Biofizyka, wykład H

Genom człowieka - 6 Gpz (wtf?, czemu nie 3,3 Gb? czy 3,3 Gb to haploidalny zestaw?)

da się ustalić sekwencję około 400 nukleotydowe, wiec genom człowieka trzebaby podzielić na 10 000 000 kawałków

WGS - włiole genome shotgun

tnie sie restryktazami na przypadkowe kawałki, klonuje się w bakteriach I otrzymuje bibliotekę, potem się składa - kawałki te mają wspólne części - do składania wykorzystuje się zaawansowane techniki komputerowe

Sekwencjonowanie krótkich kawałków DNA:

1)    chemiczna metoda Maxam-Gilberta (specyficzne z cięcie łańcucha oligonukleotydowego od końca 5' - selektywne cięcie na lewo od wybranej zasady na końcu 5' sekwencjonowanego oligonukleotydu znakuje się fosforem radioaktywnym

nie widać po elektroforezie takich cząsteczek, które w wyniku cięcia zgubiły znakowany koniec

stosuje się żele rozdzielające oligonukleotydy z dokładnością do jednego nukleotydu puszczamy żel w czterech liniach; G, A+G, T+C, C odczytujemy od końca 5', czyli od dołu żelu (najkrótsze DNA) trzeba zidentyfikować co jest pierwszym nukleotydem w inny sposób sekwencjonowanie jednoranzowo do kilkudziesięciu nukleotydów

2)    technika kontrolowanego przerwania replikacji (Sangera) - obecnie rutynowo stosowana, również zautomatyzowana

nie tnie się DNA, ale syntetyzuje

musimy uzyskać kawałki DNA różniące się o 1 nukleotyd syntetyzujemy nić komplementarną na matrycy wykorzystujemy polimerazę, warunki zautomatyzowane

polimeraza wymaga primera, jeśli tniemy restryktazami to są lepkie końce, które mogą być primerami

trzeba kilka nukleotydów określić na końcu 5' żeby zrobić primera 4 niezależne probówki, w każdej obok dNTPsów wprowadzamy modyfikowane nukleotydy - 2 ’,3’-deoksynukleotydy - przyłączają się one do nowosyntetyzowanej nici, ale po ich przyłączeniu nie może już dojść do dalszej elongacji (brak grupy hydroksylowej przy węglu 3’) - takich dideoksynukleolydów trzeba dodać około 1/100 tego, co nukleotydów zwykłych

otrzymujemy kawałki różnej długości kończące się na 2 ',3'-dideoksynukleotydach każdy primer jest znakowany etykietą fluorescencyjną

Przykład sekwenatora - ABI PRISM 3000, wykorzystuje elektroforezę kapilarną (1,6*10^A5 nk/dobę, genom w ciągu roku)

Solexa - technika sekwencjonowania z wykorzystaniem superkomputerów i jednoczesnym składaniem wielu kawałków

3)    technika z zastosowaniem szczypiec optycznych (trzymają matrycę i polimerazę) i obserwacja jak porusza się polimeraza przy niedoborze jednego z nukleotydów (jak brakuje jednego nukleotydu to jak polimeraza musi go włączyć to jest przestój i