3830763958

Zadania badawcze:

Ekspresja w układzie prokariotycznym lekkiego łańcucha regulatorowego miozyny (myosin regulatory light chain) Fasciola hepatica oraz określenie właściwości immunomodulacyjnych badanego antygenu (nowe zadanie)

Celem badań było sklonowanie, uzyskanie rekombinowanego białka oraz określenie właściwości immunomodulacyjnych wymienionego białka, z wykorzystaniem linii komórkowej monocytów bydlęcych. Na podstawie wcześniej poznanej sekwencji nukleotydowej lekkiego łańcucha miozyny F. hepatica zaprojektowane zostały startery do PCR. Matrycą do PCR była uprzednio otrzymana biblioteka cDNA stworzona na bazie mRNA F. hepatica. Otrzymany produkt wielkości około 600 pz, został poddany reakcji ligacji z wektorem do klonowania pGem T Easy. W celu ostatecznego potwierdzenia poprawności otrzymanego produktu wyizolowane plazmidy poddano reakcji sekwencjonowania, która w przypadku 4 z nich potwierdziła zgodność otrzymanych konstruktów z sekwencją zamieszczoną w bazie danych GenBank. Aby uzyskać rekombinowany łańcuch lekki miozyny F. hepatica, kodujące go cDNA połączono z DNA wektora pET 28a, który jest prokariotycznym wektorem ekspresyjnym. Wykorzystując system pET 28a w celu uzyskiwania rekombinowanych białek konieczne jest wykorzystanie odpowiednich szczepów bakterii kompetentnych, w tym przypadku wykorzystano bakterie E.coli BL21. Podobnie jak w poprzednich etapach eksperymentu pierwszym krokiem była selekcja kolonii bakteryjnych zawierających pożądany rekombinowany konstrukt DNA. W tym celu przeprowadzono analizę restrykcyjną plazmidów wyizolowanych z wytypowanych kolonii bakteryjnych. Kolejnym etapem otrzymywania rekombinowanego białka było przygotowanie płynnej hodowli zaszczepionej kolonią bakteryjną niosącą rekombinowany plazmid pET 28a. Po uzyskaniu przez hodowlę gęstości optycznej równej 0,6 mierzonej przy fali długości 600nm, dodano do niej odpowiednią ilość IPTG w celu aktywacji operonu laktozowego i aktywacji ekspresji rekombinowanego białka. Hodowle prowadzono jeszcze przez 4 godziny, po czym z hodowli odwirowano osad bakteryjny, który posłużył do dalszych procedur, mających potwierdzić obecność w osadzie rekombinowanego białka (dot-blot). Niestety mimo kilku podjętych prób indukcji nie udało się stwierdzić obecności rekombinowanego lekkiego łańcucha regulatorowego miozyny F. hepatica w badanych osadach bakteryjnych. Brak rekombinowanego białka uniemożliwił przeprowadzenie analizy wpływu immunomodulacyjnego rekombinowanego lekkiego łańcucha regulatorowego miozyny na linie monocytów bydlęcych