5973830126

v.diagnostykalaboratoryjna.i

gnozowaniu rumienia zakaźnego, objawów poliartralgii, u kobiet w ciąży).

3.2.    Badania diagnostyczne metodami biologii molekularnej

Metody molekularne oparte na wykrywaniu kwasu nukleinowego wirusa stanowią nowoczesne i czule narzędzie w diagnozowaniu zakażenia parvowirusem B19. Obecnie stosowane testy oparte na amplifikacji kwasów nukleinowych generują wyniki jakościowe bądź ilościowe. Nowoczesną metodą, współcześnie najczęściej stosowaną, jest reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym {real-time PCR), która wykrywa pojedyncze kopie wirusa w różnym materiale, np. pełnej krwi, osoczu, surowicy, płynie owodniowym, tkankach. Metoda ta przy wykorzystaniu technik fluorescencyjnych pozwala ocenić ilość zamplifikowanego produktu w trakcie trwania reakcji PCR. Jej zastosowanie umożliwia ilościową analizę DNA B19V oraz monitorowanie przebiegu zakażenia w czasie. Dzięki temu możliwe jest rozgraniczenie infekcji istotnych (zazwyczaj w ostrej fazie zakażenia, manifestujące się wysoką wiremią oraz powiązane z objawami klinicznymi) i nieistotnych klinicznie (przeważnie charakteryzujące się niską DNA--emią oraz niezwiązane z objawami klinicznymi). W przypadku zastosowanego postępowania ograniczającego infekcję ilościowe metody molekularne pozwalają ocenić jego skuteczność.

3.3.    Inne metody diagnostyczne

Test Western biot może być uzupełnieniem testu ELISA. Pozwala on zróżnicować odpowiedź immunologiczną chorego wobec białek VP1,VP2 i NS1 parvowirusa BI 9. Dzięki temu można ocenić fazę zakażenia, a więc czy jest to zakażenie ostre, przewlekłe czy reinfekcja.

Dodatkowym, pomocniczym badaniem szacującym czas trwania zakażenia jest test do oznaczania awidności przeciwciał klasy IgG. Badanie jest przydatne w sytuacji, gdy w surowicy chorego nie są obecne przeciwciała klasy IgM. Wysoka awidność przeciwciał pozwala wykluczyć infekcję w ostatnich kilku tygodniach i wskazuje na fazę przewlekłą infekcji.

Badanie cytologiczne szpiku stanowi cenne poszerzenie diagnostyki zakażenia parvowirusem B19, w szczególności w przypadku pacjentów w klinikach i poradniach hematologicznych. U osób zakażonych BI 9V w obrazie mikroskopowym szpiku można zaobserwować olbrzymie pronormoblasty. Jednakże należy pamiętać, iż badanie to nie może być jedynym kryterium rozstrzygającym, bowiem komórki te są często nieobecne, np. u pacjentów z HIV czy z innymi przewlekłymi infekcjami. Stwierdzenie wspomnianego typu komórek jest wskazaniem do przeprowadzenia diagnostyki wirusologicznej. Badanie polimorfizmu genomu parvowirusa B19 z zastosowaniem metod sekwencjonowania pełni ważną rolę poznawczą, szczególnie w trakcie analiz epidemiologicznych, ustalaniu dróg przenoszenia zakażenia czy modyfikacji istniejących testów diagnostycznych o nowo wykrywane warianty wirusa [4,10,28].

4.Trudności i ograniczenia diagnostyki laboratoryjnej

Posługiwanie się zarówno badaniami metodami serologicznymi jak i molekularnymi niosie ze sobą trudności i ograniczenia.

Badania immunoenzymatyczne obarczone są błędem związanym z istniejącym prawdopodobieństwem uzyskania wyników ujemnych oraz fałszywie dodatnich.

Przeciwciała anty-B19V nie są wykrywane w pierwszej fazie zakażenia - podczas gwałtownej replikacji wirusa, która prowadzi do osiągnięcia maksymalnego stężenia DNA B19V. Szacuje się, że okres okienka serologicznego trwa nie dłużej niż 14 dni i jest to parametr specyficzny dla testów różnych producentów.

W niektórych sytuacjach, zwłaszcza gdy stężenie wirusa jest bardzo wysokie, okres, w którym nie są wykrywane swoiste przeciwciała ulega wydłużeniu. Zjawisko to ma miejsce np. w początkowej fazie zakażenia, kiedy dochodzi do całkowitego związania przeciwciał neutralizujących z wirionami parvowirusa B19. Aktywne domeny przeciwciał, które determinują ich swoistość mogą być w takiej sytuacji trudno dostępne i w rutynowym badaniu można uzyskać wynik fałszywie ujemny [32],

Zaobserwowanie serokonwersji umożliwia rozpoznanie zakończenia wczesnej fazy infekcji oraz może wskazywać na rozpoczęcie przewlekłej fazy zakażenia B19V. Wykrycie wyłącznie przeciwciał klasy IgG nie zawsze pozwala zróżnicować aktualną infekcję od zakażenia przebytego. Badania anty-B19V nie są wystarczającym narzędziem diagnostycznym u osób z upośledzoną odpornością, leczonych immunosupresją czy w diagnozowaniu zakażenia B19V u płodu [6,33].

Diagnostyka zakażenia parvowirusem BI 9 oparta na technikach biologii molekularnej również niesie ze sobą pewne trudności. Niektóre testy zarówno komercyjne jak i tzw. home--made charakteryzują się obniżoną czułością kliniczną wykrywania niektórych form polimorficznych, w szczególności genotypu 2 i 3 lub w ogóle ich nie wykrywają. Dlatego też, podejmując decyzje o zastosowaniu danego testu, należy mieć pewność, że wykrywa wszystkie formy polimorficzne B19V z taką samą czułością [33-37],

Istotne trudności diagnostyczne związane są także z ryzykiem otrzymania wyników fałszywie ujemnych w próbkach z wysoką wiremią. Z taką sytuacją możemy mieć do czynienia we wczesnej fazie zakażenia lub u osób z osłabioną odpornością, gdy wiremia może osiągnąć poziom 10^U lU/ml. Wówczas w trakcie badań metodą real-time PCR, aby uniknąć wydania wyniku fałszywie ujemnego konieczna jest wnikliwa analiza wykresu flu-orescencji. Należy podejrzewać, że mamy do czynienia z wynikiem fałszywie ujemnym, gdy cała linia krzywej fluorescencji w próbce badanej przebiega powyżej tzw. linii odcięcia (ang. treshold). Taka sytuacja może mieć miejsce wówczas, gdy stężenie wirusowego DNA jest skrajnie wysokie (m.in. powyżej zakresu liniowości testu). W związku z tym nie można wyznaczyć wartości Ct. W przypadku podejrzenia zakażenia B19V ze skrajnie wysoką wiremią ostateczną interpretację wyniku należy oprzeć na analizie rozcieńczonej próbki [38,39].

Ze względu na możliwość wystąpienia wysokiej wiremii szczególnie ważne jest zachowanie procedur ograniczających możliwość kontaminacji. Wygenerowanie wyniku fałszywie dodatniego może nastąpić nie tylko na skutek zanieczyszczenia ujemnej próbki