8719220275

rozdział i określanie struktury białek

Aby móc badać strukturę białek, należy je wpierw wyizolować w stanie czystym, tzn. pozbawić zanieczyszczeń i oddzielić od innych białek. Do najczęściej stosowanych technik oczyszczania i izolacji białek należą:

Chromatografia jonowymienna i HVE - stosowane są do aa i polipeptydów; podstawą rozdziału jest ładunek elektryczny.

Filtracja żelowa z użyciem wysokich stężeń (1-4M) kwasu mrówkowego lub octowego - stosowana do wielkocząsteczkowych hydrofobowych peptydów; wykorzystuje odmienne zatrzymywanie i wymywanie peptydów z porów sita molekularnego (Sephadex).

HPLC w odwróconym układzie faz (niepolarny nośnik + polarny rozpuszczalnik) - stosowana j.w., czasem w połączeniu z poprzednio omówiona metodą - do oczyszczania złożonych mieszanin peptydów, otrzymywanych przez częściowe trawienie białek.

HVE na sitach molekularnych (sączenie molekularne) - technicznie przeprowadza się na skrobii, agarozie lub żelu poliakrylamidowym (PAG; usieciowany polimer akrylamidu). Stosuje się do polipeptydów i polinukleotydów. Próbkę w buforze nanosi się na płytkę lub do rurki, rozdziela elektroforetycznie i ostatecznie identyfikuje - peptydy błękitem brylantowym Coomassie lub solami srebra, zaś polinukleotydy bromkiem etydyny. Czasem wykorzystuje się odmianę tej metody w warunkach denaturujących (mocznik, SDS) - łańcuch peptydowy ulega wówczas rozprostowaniu, dodatkowo wiążąc na powierzchni ładunek ujemny proporcjonalnie do swojej wielkości (właściwie do ilości wiązań peptydowych), więc rozdział elektroforetyczny opiera się tu pośrednio na masie cząsteczkowej. Metodę PAGE-SDS stosuje się więc do określania masy cząsteczkowe białek przez porównanie ich ruchliwości elektroforetycznej z ruchliwościami wzorców o znanych masach.

Po uzyskaniu czystego białka można przystąpić do stopniowego określania jego struktury. Wiele białek składa się z > 2 łańcuchów polipeptydowych połączonych wiązaniami niekowalencyjnymi lub przez mostki dwusiarczkowe, które muszą być rozbite przed sekwencjonowaniem. W tym celu roztwór badanego białka traktuje się czynnikami denaturującymi (mocznik, chlorowodorek guanidyny), które rozbijają wiązania wodorowe i niektóre niekowalencyjne oraz czynnikami redukującymi lub utleniającymi, które pozbawiają peptydy mostków dwusiarczkowych - czynniki utleniające, np. kwas nadmrówkowy (HCOOOH), utleniają reszty cystyny do kwasu cysteinowego (Cys-SCV), natomiast czynniki redukujące, np. 2-merkaptoetanol, redukują je do cysteiny (Cys-SH).

Polipeptydy wielkocząsteczkowe rozbija się, czasami kilkuetapowo, na mniejsze fragmenty o długości 20-60 aa. Do tego celu używa się następujących odczynników (w nawiasach podano rodzaj rozbijanego wiązania): bromocyjan - CNBr (Met-X), trypsyna (Lys-X, Arg-X), o-jodobenzen (Trp-X), hydroksyloamina (Asn-Gly), proteaza V8 Staphylococcus aureus (Glu-aa hydrofobowy), łagodna hydroliza kwaśna (Asp-Pro).

Przed rozpoczęciem sekwencjonowania białka określa się jego skład aminokwasowy poprzez poddanie go kwaśnej hydrolizie (6M HC1, ll^oC, 1-4 doby), a następnie rozdzielenie i identyfikację wolnych aa metodą HPLC, chromatografii jonowymiennej bądź elektroforetyczną. Wadą takiego postępowania jest zniszczenie struktury wielu aa przez agresywne środowisko - całkowicie niszczone są Trp i Cys, częściowo - Met, Tyr, Ser, Thr, ponadto zachodzi deamidacja Glu i Asn, natomiast wiązania Val-Val, Ile-Ile, Val-Ile, Ile-Val wykazują oporność na ten rodzaj hydrolizy. Aby tego uniknąć, wykonuje się kilka zabiegów:

Cys utlenia się do kwasu cysteinowego - opornego na działanie kwaśnego środowiska, obecność Trp oznacza się po hydrolizie zasadowej (która za to niszczy Ser, Thr, Arg i Cys), określa się tempo spadku poziomów Ser i Thr, po czym dane te ekstrapoluje się do czasu 0, obecność aa rozgałęzionych oznacza się po 96 h hydrolizy,

obecność aa kwaśnych oraz ich amidów określa się łącznie jako Glx (Glu + Gin) i Asx (Asp + Asn).

Po określeniu procentowego udziału poszczególnych aa w budowie badanego białka, można przystąpić do jego sekwencjonowania, czyli określenia struktury I-rz. Istnieje tu kilka metod:

Najstarsze metody sekwencjnowania opierają się na przeprowadzeniu N-końcowego aa peptydu w określoną pochodną, hydrolizę peptydu oraz identyfikację powstałej pochodnej aa. Taka jest m. in. idea metody Sangera - używa się w niej odczynnika Sangera - DNFB (2,4-dinitro-l-fluorobenzenu), który reaguje wyłącznie z N-końcowymi resztami aa, po czym prowadzi się hydrolizę i identyfikację.

Bardziej zaawansowana metoda Edmana wnosi automatyczne usuwanie i identyfikację N-końcowych reszt aa peptydów w postaci pochodnych. Wykorzystuje się tu odczynnik Edmana -fenyloizotiocyjanian, który reagując z końcem aminowym peptydu daje kwas fenylotiohydantoinowy, który w środowisku kwaśnym i obecności niehydroksylowych rozpuszczalników (np. nitrometanu) rozpada się na fenylotiohydantoinową pochodną aa oraz peptyd skrócony o jeden N-końcowy aa. W przeciwieństwie do metody Sangera, po usunięciu N-końcowego aa peptyd pozostaje niezmieniony.

20