8941511309

Jeżeli, eluent poprzedni i następny wzajemnie się nie mieszają, a szczególnie gdy stosowane są roztwory buforowe, lub eluenty zawierające substancje będące w stanie czystym fazą stałą, należy upewnić się, że kolejna ciecz pompowana przez aparat nie spowoduje wytrącenia się stałego osadu wewnątrz chromatografu, ani powstania emulsji. W takich przypadkach należy zastosować ciecz pośrednią, o której wiadomo, że jest dobrym rozpuszczalnikiem składników poprzedniego i następnego eluentu, np. wodę destylowaną, gdy ma być stosowany bufor zawierający sole nieorganiczne, albo tetrahydrofuran, aceton lub dioksan, gdy poprzedni i następny eluent są cieczami bez dodatku substancji stałych, ale wzajemnie się nie mieszają. Pomocne może być wprowadzenie strzykawką poprzedniego eluentu do następnego zawartego w probówce w celu sprawdzenia czy nie powstaje osad lub emulsja;

Zawsze należy każdą ze stosowanych cieczy pośrednich przepłukać także kanał odniesienia detektora, gdy detektor taki kanał posiada (np. w przypadku detektora refraktometrycznego);

Podstawowy problem związany z fazą ruchomą w HPLC: ciśnienie wskazywane przez wyświetlacz na płycie czołowej pompy waha się więcej niż +/- 2 bary, a jednocześnie widać okresowe zasysanie małych banieczek z przewodu ssawnego do pompy. Przyczyna: zapowietrzony eluent, albo eluent o zbyt wysokiej prężności par, albo/i zatkany zanieczyszczeniami filtr ssawny pompy. (Uwaga! Eluent przed użyciem musi być przefiltrowany przez filtr 0,45 um, jeżeli nie ma pewności, że wykonał to producent, a także nie wolno dopuścić do powstania życia biologicznego w eluencie nietoksycznym dla bakterii i grzybów - stosować 0.5 mM azydek sodu). Należy przedmuchać filtr ssawny pompy sprężonym powietrzem w kierunku odwrotnym do kierunku przepływu cieczy, dodatkowo odpowietrzyć eluent i postawić go powyżej poziomu głowicy pompy.

ad.2 Sposób połączenia kolumny z dozownikiem i detektorem powinien być taki, żeby zminimalizować powstające ewentualne objętości martwe. W ten sposób zmniejsza się udział objętości martwych stosunek rozmyciu pików chromatograficznych. Przez cały czas trwania wymiany eluentu kolumna powinna być odłączona i zastąpiona łącznikiem (dwójnikiem). Kolejna kolumna potrzebna do wykonania oznaczeń, powinna zostać przyłączona w miejsce dwójnika dopiero po upewnieniu się, że cały aparat został poprawnie przepłukany i zawiera eluent, który aktualnie będzie wykorzystywany do analizy. Zawór dozujący w pozycji powinien być w pozycji „inject”.

Jeżeli klumna chromatograficzna podłączana jest do układu po raz pierwszy lub też nie była używana przez dłuższy okres czasu należy - po podłączniu jej do układu chromatograficznego - zastosować wzrastający przepływ fazy ruchomej (od najmniejszego do właściwego). Gwałtowne włączenie pompy pompującej fazę ruchomą z dużym przepływem może zruszyć złoże upakowane w kolumnie chromatgraficznej.

Przy rozpoczynaniu analizy chromatograficznej jedną z bardzo ważnych rzeczy jest ustalenie równowagi kolumny chromatograficznej. Jak długo należy kolumnę stabilizować zależy od jej stanu, stężenia składników fazy ruchomej oraz ich wskaźnika retencji. Ustalenie stanu równowagi jest uwarunkowane przez prędkość, z którą składniki fazy ruchomej są transportowane do kolumny lub mogą z niej być usunięte. Jeżeli stężenie dodatków organicznych w fazie ruchomej jest niskie, ustalenie równowagi zajmie sporo czasu, np.: jeżeli kolumna wcześniej nie miała kontaktu z metanolem, a jego stężenie w fazie ruchomej wynosi 1%, to potrzeba przepuścić przez kolumnę co najmniej 10-krotną jej objętość w celu dostarczenia odpowiedniej ilości metanolu. Na Rysunku poniżej przedstawiono nieustabilizowaną linię bazową świadczącą o zbyt krótkim czasie stabilizacji kolumny.

Nieustabilizowana linia podstawowa ze względu na zbyt krótki czas stabilizowania kolumny.