1950083550

Źródłem materiału genetycznego są dostępne biblioteki genowe. Dla każdej wybranej sekwencji syntetyzowane są sekwencje komplementarne, które nazywa się sondami. W zależności od specyfiki przyjętej technologii sondy mogą być sekwencjami cDNA lub oligonukleotydów.

2.    Przygotowanie mikromacierzy

Etap ten może być przeprowadzony przez zespół prowadzący eksperyment lub wykonany przez specjalistyczną organizację zewnętrzną. Zbiory identycznych kopii sond są umieszczane w oddzielnych komórkach płytki. Komórki są adresowane poprzez numer wiersza i kolumny, co jest szczególnie istotne dla późniejszej analizy ekspresji konkretnych sekwencji. W zależności od typu macierzy sondy są przygotowywane niezależnie i następnie nakładane na płytkę lub są syntetyzowane in situ.

W większości przypadków z punktu widzenia analizy danych wynikowych najlepiej jest móc skojarzyć każdą komórkę mikromacierzy z dokładnie jednym genem. Niestety często uzyskanie takiej fragmentaryzacji materiału genetycznego nie jest możliwe i sekwencje składające się na pojedynczy gen znajdują się w różnych lokacjach. Ponadto ze względu na późniejszą weryfikację celowe jest umieszczanie materiału dotyczącego tego samego genu (replikantów) w kilku osobnych komórkach płytki. Sposób rozłożenia materiału genetycznego musi być odpowiednio uwzględniony po pomiarze intensywności ekspresji w celu wyznaczenia jej poziomów dla poszczególnych sekwencji.

3.    Przygotowanie sekwencji badanych

W celu pomiaru intensywności ekspresji genów danej komórki w pierwszej kolejności należy wyprowadzić z jej środowiska całe transkrybowane matrycowe RNA. Następnie materiał jest odwrotnie transkrybowany do postaci cDNA. Zauważmy, że etap ten jest analogiczny do opisanego wcześniej klonowania materiału genetycznego, dokonywanego np. w celu budowy biblioteki cDNA.

Otrzymane sekwencje cDNA są specjalnie znakowane poprzez chemiczną modyfikację ich łańcuchów. Znakowanie nie ingeruje w pierwszorzędową strukturę kwasu. Proces może być realizowany w czasie odwrotnej transkrypcji lub już na otrzymanym cDNA. Pierwsze rozwiązanie jest zalecane ze względu na bardziej równomierną inkorporację barwnika przez cząsteczki.

Celem znakowania jest umożliwienie odnotowania przez urządzenia miernicze zajścia hybrydyzacji pomiędzy sekwencjami badanymi i sondami. Przykładowe znakowanie może być związane ze zjawiskami o charakterze fluorescencyjnym lub radioaktywnym.

Pojedyncza nić oznakowanego kwasu jest fragmentaryzowana na odcinki, które będą dołączać się do komplementarnych odcinków na płytce.

Ze względu na późniejszą weryfikację pomiaru często przygotowuje się również zestaw sekwencji kontrolnych, które są później wykorzystywane w procesie normalizacji.

4.    Hybrydyzacja

Płytka z sondami jest umieszczana w środowisku sekwencji badanych. Może się to odbywać przez kontakt ze sporządzoną miksturą lub odseparowanymi grupami sekwencji. Hybrydyzacja jest przeprowadzana przy użyciu różnych technik, np. fluorocytometrii lub elektroforezy. Na etapie tym dochodzi do powiązania się badanych sekwencji z komplementarnymi sondami. Połączenie dwóch odpowiadających sobie sekwencji genetycznych umożliwia późniejszą rejestrację użytego znacznika.

18