274845133

Wykonanie

Materiały i odczynniki

do oznaczania aminotransferazy alaninowej, AlaT

1.    0,4 M bufor fosforanowy pH 7,4 (10 ml)

2.    1 M roztwór L-alaniny (2,5 ml)

3.    Mieszanina podstawowa (przygotować w dniu oznaczeń): 0,2 M bufor fosforanowy, 0,2 M L-alanina (10 ml)

4.    0,2 M 2-oksoglutaran sodowy (250 pl)

5.    Naważka NADH służąca do sporządzenia roztworu o stężeniu 10 mg ml^-1 (100 pl)

6.    Dehydrogenaza mleczanowa

do oznaczania aminotransferazy asparaginianowej, AspT

7.    0,4 M bufor fosforanowy pH 7,6 (10 ml)

8.    2 M roztwór L-asparaginianu (5 ml)

9.    Mieszanina podstawowa (przygotować w dniu oznaczeń): 0,2 M bufor fosforanowy, 0,5 M L-asparaginian (10 ml)

10.    0,2 M 2-oksoglutaran sodowy (250 pl)

11.    Naważka NADH służąca do sporządzenia roztworu o stężeniu 10 mg ml^-1 (100 pl)

12.    Dehydrogenaza jabłczanowa

A.    Przygotowanie surowicy do oznaczeń

Świeżo pobraną krew umieścić na ok. 2 godziny w cieplarce nastawionej na 37°C, celem wytworzenia skrzepu. Żółtawą ciecz znad skrzepu odwirować i tak otrzymany preparat wykorzystywać do oznaczeń. Studenci otrzymują gotowy preparat surowicy

B.    Pomiar aktywności aminotransferaz

Pomiary oznaczyć następująco: oznaczanie aktywności AlaT - próby Nr 1, 2, 3; oznaczanie aktywności AspT - próby 4, 5, 6.

Korzystając ze stężonych roztworów (odpowiednio: odczynniki nr 1 i nr 2 lub odczynniki nr 7 i nr 8), przygotować 10 ml mieszaniny podstawowej potrzebnej do pomiaru aktywności wybranej aminotransferazy (odczynnik nr 3 lub nr 9). Na 15 min przed pomiarem włączyć spekol. Ustawić długość fali 340 nm. Pomiar prowadzić w temperaturze pokojowej.

Do kuwety odmierzyć: 500 pl odpowiedniej mieszaniny podstawowej, 15 pl NADH, odpowiednią dehydrogenazę (5 pl enzymu rozcieńczonego według wskazówek prowadzących) oraz 25 pl surowicy. Zawartość kuwety uzupełnić wodą do takiej objętości, aby w chwili rozpoczęcia reakcji, czyli po dodaniu 30 pl 2-oksoglutaranu, całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 1 ml. Następnie wymieszać i preinkubować przez 5 min. Następnie zmierzyć absorbancję wobec wody jako próby odniesienia. Rozpocząć reakcję dodaniem 30 pl 2-oksoglutaranu. W momencie dodania 2-oksoglutaranu uruchomić pomiar czasu i odczytywać zmiany absorbancji co 15 sekund przez ok. 5 min. Objętość próby badanej (surowicy) jest dobrana prawidłowo, jeśli zmiany absorbancji w ciągu 15 s wynoszą około 0,020-0,030 jednostek absorbancji. Jeśli otrzymane wyniki odbiegają od tej wartości, powtórzyć pomiar, odpowiednio zmiejszając lub zwiększając rozcieńczenie surowicy. Jeśli otrzymany wynik jest zgodny z oczekiwaniami, wykonać jeszcze dwa powtórzenia, stosując tę samą objętość surowicy.

C.    Opracowanie wyników

Zanotowane dane pomiarowe należy przeliczyć, posługując się arkuszem sprawozdania.

Zmiany wartości absorbancji przy 340 nm w czasie należy odłożyć na wykresach (dobierając odpowiednio skalę na osi rzędnych) i wyliczyć szybkość początkową reakcji V₀ = A absorbancji min'¹. Otrzymane wyniki przeliczyć na aktywność całkowitą w kuwecie i wyrazić w pmolach min'¹, wiedząc, że milimolowy współczynnik absorbancji dla NADH przy 340 nm wynosi e = 6,22 mM'¹ cm'¹. Podać aktywność transaminaz w 1 ml surowicy krwi królika. Wyniki zestawić w tabeli, na koniec obliczając średnią aktywność transaminaz w 11 surowicy.