290421293

— 51 —

Pour donncr un exemple concret, je vous parlerai de ]a construction d'un vecleur plasmidique bacterien intćressant en biologie vćgetale, puisqu'il doit trans-mettre de l'ADN etranger a du Rhizobiurn ou de YAgrobacterium. Pourąuoi vouloir obtenir un teł vecteur ? D'abord dans un but de connaissance fondamentale de la symbiose : en efTet, chaque Rhizobiurn est specifiąue d’une Legumineuse detcrminee; on connait mai les raisons biochimiques et les determinants gćnetiąues de cette spćcificite; or, la plupart des Rhizobiurn porlent des plasmides de taille moyenne dont on ne connait pas le role; Tobjectif est de fairc penetrer des fragmenls de ces plasmides dans differents types de Rhizobiurn et de rcchercher ensuite des modifications de specificite.

Ensuite, sur un plan appliąue : la nitrogenase qui permet de fixer 1'azote atmospherique en symbiose, consomme une energie importante perdue sous formes d'ions H+; Tensemble des Rhizobiurn, a l'exccption de quelques souches de R. japonicum, ne possede pas les genes Hup, codant pour les enzymes capables de recuperer ces ions, donc d'augmenter leurs rendements dans la fixation de 1'azote. II parait donc interessant de transmettre l’ADN portant ces genes a des Rhizobiurn qui en sont depourvus.

La construction de ce vecteur a etć realisee par J.P. Facon et collaborateurs (1). Les qualites exigees pour un tel vecteur sont : la possibilite de se rćpliquer, donc de survivre a la fois chez Rhizobiurn ou on veut rintroduire et E. coli qui servira d'hóte intermediaire, la propriete d'etrc amplifiable pour pouvoir etre prepare aisóment in vitro, une petite taille autorisant son transfert par transformalion, la presence enfin, de marąueurs et de siles de restriction convenables. Le choix s'est porte sur un plasmide hybride dont une partie a ete cxtraite de R. meliloti M19 (petit plasmide pRme 19a); 1’autre provient d'£. coli (plasmide pBR322 facile-ment amplifiable, portant les genes de resistance a rampicilline Ap-r, a la tetra-cycline Tc+ et dont les sites d'hydrolyse par les enzymess de restriction sont connus, car ce plasmide est un des plus utilises dans les manipulations genetiques). Les differentes endonucleases, provoquant un seul site de coupure chez pBR 322, comme Cla I ou Sal I, ont ete essayees sur pRme !9a afin d’en trouver une capable de couper ce demier plasmide en un scul point. L'enzymc Sal I obeit a ce critćre et son site d’action se trouvc dans le g^ne de resistance a la tetraeycline. Les deux plasmides sont donc extraits de leur cellule d'origine, linearises par Sal I, puis mćlanges en presence de ligase efin de ligaturer au hasard in vitro. Si au cours de cette operation le plasmide pRme 19a s'est rccircularisć, il nc porte aucun marqueur de resistance. Si le pBR322 s'est reconstituć, il porte les 2 marqueurs de resistance. Par contrę, dans le cas ou le premier s'est inserć au niveau du site Sal I de pBR322_f cclui-ci separe le gene Tc^r en deux fragmenls, et inhibe donc sa transcription. Les plasmides hybrides (pBRRMl) ne porterom que la resistance a 1'ampicilline et non <t la tćtracycline. Pour cloner les plasmides hybrides, on met le melange des plasmides prćparćs in viiro cn presence d’£. coli (C. 600) de telle sorte quc ces plasmides y penfctrent par transformation. On selectionne alors sur milieu nutritif solide, les elones resistants & 1'ampicilline et scnsibles & la tćtracycline. Le contenu plasmidique de ces elones est alors isolć apre-s amplification ; c'cst par cette methode qu^ra etó isolć le plasmide hybride pBRRMl (fig. 1); par etude en electrophorese, on constate que sa taille est plus importante que la somme des tailles des deux plasmides qui le composent (augmentalion d'cnviron 1 kilobase rćsultant de la transposition in vivo d'une sćquence d’insertion, lors du passage de ce plasmide dans la cellule E. coli, du chromosome de ce dernier vers le