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Spis Treści

1. Analiza modyfikacji chromatyny w cyklu komórkowym........................................5

Wstęp........................................................................................................................................................5

Chromatyna..........................................................................................................................................5

Potranslacyjne modyfikacje histonów..................................................................................................5

Fosforylacja histonu H3.......................................................................................................................6

Hodowle komórek roślinnych in vitro.................................................................................................6

Elektroforeza białek w żelach poliakrylamidowych............................................................................7

Elektroforeza w warunkach natywnych.....................................................................................8

SDS-PAGE.................................................................................................................................8

NuPAGE.....................................................................................................................................9

Żele mocznikowe.....................................................................................................................10

Ogniskowanie izoelektryczne (IEF).........................................................................................10

Elektroforeza dwukierunkowa 2DE.........................................................................................11

Barwienie białek po elektroforezie....................................................................................................11

Coomassie Brilant Blue............................................................................................................11

Barwienie srebrem....................................................................................................................11

Znaczniki fluorescencyjne........................................................................................................11

Imunodetekcja białek - Western Biot................................................................................................12

Transfer mokry.........................................................................................................................12

Transfer pół-suchy....................................................................................................................12

Blokowanie membran...............................................................................................................13

Wiązanie przeciwciał................................................................................................................13

Detekcja....................................................................................................................................13

ECL...........................................................................................................................................13

Cel doświadczenia..................................................................................................................................13

Schemat doświadczenia:.........................................................................................................................13

Dzień 1. Izolacja białek z materiału roślinnego (ok. 3 h)......................................................................14

Dzień 2, 3. Elektroforeza SDS-PAGE (ok. 3 h), barwienie (przez noc).................................................15

Przygotowanie żelu do SDS PAGE....................................................................................................15

Przygotowanie próbek do naniesienia na żel.....................................................................................16

Elektroforeza......................................................................................................................................16

Barwienie białek w żelu.....................................................................................................................17

Dzień 4. Western biot.............................................................................................................................18

Dzień 5. Detekcja metodą ECL...............................................................................................................19