5192605682

46 A. KOZIK [14]

jedynym kierunkiem elektroforezy powinowactwa, który wykorzystywano do wyznaczania parametrów oddziaływania drobnocząsteczkowych li-gandów z białkami, jest elektroforeza w żelach poliakryloamidowych. Posługiwano się w niej formalizmem analogicznym jak w przypadku chromatografii powinowactwa. W przypadku białek monowalencyjnych, odległość 1 na jaką pasmo białkowe wędruje w żelu zawierającym ligand

unieruchomiony (L) oraz ligand wolny (L), związane jest ze stałymi asocjacji K, K równaniem (112):

(równanie 17)

I _ i+Mi

lo-l “ K[L]

gdzie 1₀ — oznacza ruchliwość w przypadku braku oddziaływania z że

lem, tj. przy 1 = 0. Parametry wiązania łatwo odczytać z wykresu j-:

([L]).

Równanie powyższe jest słuszne przy szeregu założeń. M.in. ruchliwość białka oraz kompleksu BL muszą być identyczne, tworzenie kompleksów musi być reakcją bardzo szybką, stężenie białka w wędrującej

strefie musi być znacznie niższe niż [L] i [L],

Szereg trudności związany jest z metodyką unieruchamiania ligandu. Jak dotąd, jedynym praktycznie osiągalnym sposobem jest przeprowadzenie polimeryzacji żelu poliakryioamidowego w obecności makrocząsteczkowej, rozpuszczalnej pochodnej ligandu, która po utworzeniu polimeru ulega fizycznemu uwięzieniu w jego sieci. Po raz pierwszy metodą taką posłużono się w przypadku naturalnych, niezmodyfikowanych polisacharydów (113), których unieruchamianie pozwoliło później na wy-r znaczanie parametrów wiązania pewnych patologicznych immunoglobu-lin (114—116) oraz lektyn (117) z cukrami. Częściej jednak rozpuszczalne, wysokocząsteczkowe dekstrany stanowią nośniki, do których przyłącza się ligandy zgodnie ze zwykłą metodyką chromatografii powinowactwa (118). Tego typu żele wykorzystano do badania oddziaływania trypsyny z p-ami-nobenzoamidyną (119) oraz szeregu białek z Blue Dextran (120). Alternatywna droga syntezy makrocząsteczki niosącej ligand polega na kopo-limeryzacji nienasyconej pochodnej ligandu z akryloamidem. Otrzymuje się liniowe, rozpuszczalne kopolimery, których masę cząsteczkową i zawartość ligandu można w pewnych granicach kontrolować (121). Technikę tę zastosowano w badaniach oddziaływań lektyn (112, 122—128) i oksydazy galaktozy (129) z cukrami, różnych enzymów z unieruchomionym AMP (130, 131). Można również syntezować kopolimery, niosące grupy reaktywne, które następnie podstawia się ligandem. To podejście wykorzystano do unieruchomienia p-aminobenzoamidyny (119) i AMP (132).

Nośniki ligandu muszą posiadać dostatecznie dużą masę cząsteczkową, gdyż całkowite unieruchomienie ligandu jest warunkiem stosował-