5783290851

MATERIAŁY I SPRZĘT LABORATORYJNY

Wzorce: naftalenu, chryzenu, fluorenu, pirenu, antracenu, metanol, acetonitryl i woda do HPLC, czystości „gradient grade”, probówki i fiolki szklane, pipeta automatyczna, strzykawka do HPLC z płaską igłą, naczynie na ścieki;

APARATURA

Aparaty chromatograficzne typu HPLC: pompa -» dozownik zaworowy, (albo automatyczny dozownik repetycyjny, tzw. "autosampler") —» kolumna LiChrospher RP 18e (5pm) 125x4 mm —> detektor UV typu DAD i detektor fluorescencyjny (FLD) —> integrator, albo komputerowy system rejestracji i przetwarzania danych.

WARUNKI ROZDZIELANIA I DETEKCJI

Natężenie przepływu fazy ruchomej: wartość stała w zakresie 0,5 do 1,5 ml / min, temperatura pokojowa, ciśnienie na wlocie do kolumny: do 400 bar; objętość próbki dozowanej do kolumny: 20 ul, zakres długości fali detekcji: UV - 200 do 400 nm; FLD - długość fali wzbudzenia - 250 do 410 nm, długość fali emisji - 300 do 500 nm; zróżnicowany skład eluentu, natężenie przepływu eluentu oraz stężenie substancji dozowanych do kolumny.

WYKONANIE ĆWICZENIA

Przygotowanie próbek do kalibracji i identyfikacji (wykonane w okresie przygotowania ćwiczenia)

Do kolby miarowej o pojemności 10 ml odważyć po 2 mg każdego ze wzorców - naftalenu, chryzenu, fluorenu, pirenu, antracen i uzupełnić do kreski metanolem. Tak przygotowane próbki pierwotne zmieszać w różnych proporcjach składników, oraz rozcieńczyć 10-cio do 1000 - krotnie, otrzymując 5 próbek kalibracyjnych i identyfikacyjnych. (W ten sposób przygotowane próbki umożliwiają jednoczesne wykonanie „wielopunktowej" kalibracji oraz identyfikacji czasu retencji poszczególnych składników, bez konieczności dozowania roztworów pojedynczych składników w celu identyfikacji czasu retencji).

Próbki zmieszane i rozcieńczone poddać rozdzielaniu i analizie chromatograficznej.

Warunki rozdzielania, detekcji i kalibracji

1.    Ustawić skład eluentu MeOH : H₂0 = 80:20 (albo inny, podany przez prowadzącego) oraz natężenie przepływu eluentu na poziomie 0,5 do 1,5 ml/min (konkretne wartości natężenia przepływu zostaną podane przez prowadzącego),

2.    Ustabilizować warunki rozdzielania (stabilna linia podstawowa detektora / detektorów, powierzchnia sorpcyjna kolumny „zrównoważona” ze stosowanym eluentem);

3.    Po ustabilizowaniu warunków rozdzielania wprowadzić do pętli zaworu dozującego o pojemności 20 mikrolitrów, co najmniej 50 mikrolitrów próbki (położenie "load" zaworu dozującego - dlaczego tak duża objętość próbki wprowadzonej do pętli ?) i po stwierdzeniu gotowości systemu rejestracji i przetwarzania danych (komunikat „ready for injection” i znikła ikona „klepsydry", w przypadku stosowania komputerowego systemu rejestracji i przetwarzania danych), wprowadzić próbkę do kolumny („dozować”, „wstrzyknąć” próbkę). Obserwować przebieg rozdzielania, kontrolować prawidłowość pracy aparatu, zanotować warunki rozdzielania i detekcji oraz naszkicować schemat aparatu, a także wyjaśnić z prowadzącym wątpliwości.

4.    Po zarejestrowaniu chromatogramu, odczytać czas retencji i powierzchnie poszczególnych pików oraz wydrukować raport.

5.    Zidentyfikować rozdzielone składniki mieszaniny. Identyfikacji dokonuje się dla węglowodorów aromatycznych w przypadku stosowania detektora UV-DAD, poprzez porównanie widma absorpcyjnego w zakresie UV substancji wzorcowych, albo w przypadku stosowania innych detektorów, na podstawie wartości proporcji powierzchni / wysokości pików oraz proporcji stężeń substancji w dozowanych próbkach.

6.    Zbadać jak zmienia się retencja rozdzielanych substancji (ln k) ze zmianą składu fazy ruchomej. Próbka zostanie poddana rozdzielaniu w kolumnie chromatograficznej LiChrospher RP 18e (5pm) 125x4 mm w różnych warunkach tj. przy różnym składzie fazy ruchomej (np. MeOH: H₂0 = 85:15; MeOH: H₂0 = 90:10 i innych).

7.    Wskazać optymalny skład fazy ruchomej, do rozdzielania w warunkach elucji izokratycznej WWA (naftalenu, chryzenu, fluorenu, pirenu, antracenu)

8.    W optymalnych warunkach dokonać rozdzielenia 2 -3 roztworów kalibracyjnych o stężeniach: 1,4 fig/ ml ; 3,7 fig/ ml; 11 fig/ ml każdego ze wzorców (lub innych podanych przez prowadzącego ćwiczenia)