6161619716

Granice różnych zakresów są często dosyć szerokie, dlatego należy ostrożnie analizować uzyskane wyniki.

W strukturze przestrzennej białek można najczęściej wyróżnić wiele różnych struktur drugorzędowych, dlatego też ich widma w podczerwieni mają złożony charakter. Pasma amidowe składają się w wielu różnych, zachodzących na siebie pasm składowych, charakterystycznych dla poszczególnych struktur. Znacząco komplikuje to analizę widm. Jednak stosując techniki zwiększania rozdzielczości widm można jednak uzyskać informacje o ich położeniu i natężeniu, a czasem także o ich procentowym udziale w stosunku do wszystkich struktur drugorzędowych danego białka.

Agregat"^

q-helisa~^| Pętle _j

Reszty AA

Liczba falowa / cm'¹

Rys. 5. Zakresy absorpcji poszczególnych struktur drugorzędowych występujących powszechnie w białkach. Skróty i objaśnienia: (3 - P-kartki, Ps - P-spinki (p-kartki zbudowane tylko z dwóch łańcuchów), reszty AA - grupy boczne reszt aminokwasowych, Agr. - agregaty, 3io - helisa 31₀, Pętle - rozumiane jako długie pętle, lub struktura nieuporządkowanego polipeptydu (charakterystyczna dla białek zdenaturowanych); struktury, których pasma absorpcji przesuwają się pod wpływem wymiany protonowej oznaczone zostały strzałką, prostokątami przerywanymi oznaczono zakresy absorpcji tych struktur w wodzie ciężkiej.

5.3.2. Izolacja i analiza widm biocząseczek w roztworach wodnych

Widma biocząsteczek najczęściej mierzone są w roztworach wodnych i rzadko możliwa jest bezpośrednia analiza charakterystycznych pasm absorpcji. Ogólny schemat postępowania w takich sytuacjach przedstawia się następująco:

a.    Usunięcie udziału widmowego pary wodnej

Pierwszym problemem we wstępnej obróbce danych widmowych jest usunięcie pasm absorpcji pary wodnej w zakresie pasma amidowego I i II. W dużym stopniu problem ten jest zmniejszany przez intensywne płukanie aparatu suchym azotem lub osuszonym powietrzem. Jednak nie zawsze jest to wystarczające rozwiązanie. Korekcja atmosfery opiera się najczęściej na takim dobraniu współczynnika odejmowania zmierzonego widma pary wodnej, aby uzyskać widmo w najwyższym stopniu pozbawione udziału tej paiy. Procedura odbywa się metodą "prób i błędów", a kryterium jest ocena wizualna widma.

b.    Odejmowanie udziału widmowego wody

Największym problemem w przygotowaniu widm do dalszej obróbki jest prawidłowe odjęcie widma wody (lub buforu), ponieważ nawet w bardzo stężonych próbkach natężenie pasma wody w zakresie amidu I jest od 5 do 10 razy większe, niż samego pasma amidowego I. Powszechnie stosowanym sposobem odejmowania widma wody od zmierzonego widma