7808335475

sandwich) lub odwrotnie proporcjonalna (kompetycyjna ELISA) do ilości alergenu w próbce żywności. Stężenie kompleksu przeciwciało-antygen jest wyznaczone w oparciu o krzywą wzorcową wyznaczoną przy użyciu właściwych standardów. W tym ćwiczeniu zastosowano pośredni test ELISA. Ten schemat reakcji ELISA jest najczęściej stosowany i służy do wykrywania ilości badanego białka w próbie (homogenaty tkankowe) oraz w badaniach diagnostycznych np. do ustalenia miana przeciwciał we krwi.

III. Wykonanie Oznaczenie białka

1.    Przygotowanie 10-krotnych rozcieńczeń próbki badanej w H2O destylowanej.

2.    Naniesienie 25 pl przygotowanych rozcieńczeń próbki w 3 powtórzeniach na płytkę (próba kontrolna-25 pl H2O).

3.    Przygotowanie odczynnika WR przez zmieszanie odczynnika A i B w stosunku 1:50.

4.    Dodanie do wszystkich studzienek 200 pl odczynnika WR.

5.    Inkubacja płytki w temp 37 °C przez 0,5 h w inkubatorze.

6.    Pomiar absorbancji przy długości fali X= 540 nm.

7.    Obliczenie zawartości białka na podstawie krzywej wzorcowej dla albuminy (BSA).

Test ELISA

1. Przygotowanie x-krotnych rozcieńczeń próbek w buforze węglanowym tak, aby uzyskać 1-5 pg białka na studzienkę

2.0płaszczenie płytki poprzez naniesienie do studzienek 100 pl roztworu próbki badanej w 6 powtórzeniach (3 próbki badane i 3 próbki kontrolne), inkubacja przez noc w 4°C.

3.    Usunięcie roztworów ze studzienek i przepłukanie studzienek buforem PBS przy użyciu

płuczki automatycznej (4 razy).

4.    Blokowanie miejsc niezajętych przez antygen za pomocą żelatyny, inkubacja 1 h. Etap ten

zapobiega nieselektywnemu przyłączaniu się badanych białek do fazy stałej podczas następnych etapów testu.

5.    Usunięcie roztworów ze studzienek i przepłukanie płytki buforem PBS (4 razy).

6.    Dodanie do wszystkich studzienek (poza kontrolnymi) 100 pl rozcieńczonego roztworu

surowicy ludzkiej zawierającej IgE specyficzne dla P - laktoglobuliny, inkubacja 1 h. Próbki kontrolne nie zawierają surowicy ludzkiej!!!

7. Usunięcie roztworów ze studzienek i przepłukanie płytki buforem PBS (4 razy).