8009766957

Nieomal wszystkie szczepy Escherichia coli używane w laboratoriach zawierają, co najmniej dwie metylotransferazy DNA:

Dam metylazę (M.Dam), która dodaje grupę metylową do adeniny w sekwencji GATC (produkt Gm^ćATC)

Dcm metylazę (M.Dcm), która modyfikuje wewnętrzną cytozynę w sekwencji CCWGG (W=A lub T) CC(A/T)GG do Cm⁵C(A/T)GG

Praktyczną konsekwencją tego zjawiska jest fakt, że wiele endonukleaz nie będzie trawić DNA zmetylowanego przez w/w metylazy DNA. Poniżej kilka przykładów.

Metylaza Dam E.coli, modyfikując w DNA adeninę w sekwencjach GATC, czyni je nie wrażliwymi na trawienie enzymem Mbol, natomiast tak zmetylowany DNA pozostanie wciąż substratem dla enzymu Sau3AI.

nnnGATCnnn

nnnCTAGnnn

nnn GATCnnn nnnCTAG nnn

CH₃    Mbol

nnnGATCnnn

nnnCTAGnnn

^{M Dam} nnnGATCnnn nnnCTAGnnn

I    -

CH₃    Sau3AI

Metylaza Dcm E.coli, modyfikując w DNA drugą cytozynę w sekwencjach CCWGG, czyni je nie wrażliwymi na trawienie enzymem EcoRII, natomiast tak zmetylowany DNA pozostanie wciąż substratem dla enzymu Mval.

nnnCCWGGnnn

nnnGGWCCnnn

CH₃

M.Dcm nnnCCWGGnnn

nnnGGWCCnnn"

I

ch₃

EcoRII

Mval

nnnCCWGGnnn

nnnGGWCCnnn

nnnCC WGGnnn nnnGGW CCnnn

Miejsca rozpoznawane przez niektóre enzymy mogą zawierać się lub pokrywać się częściowo z sekwencją GATC np TCGA (Taql), ATCGA (Ciał). Gdy sekwencje te zostaną zmetylowane przez M.Dam, staną się niewrażliwe na trawienie w/w enzymami. Podobna sytuacja ma miejsce w przypadku nakładania się sekwencji docelowej danego enzymu z sekwencją CCWGG modyfikowaną przez M.Dcm np AGGCCT (Stul); TGGCCA (Mści). Gdy sekwencje te zostaną zmetylowane przez M.Dcm, staną się niewrażliwe na trawienie w/w enzymami.

nnT 3ATC Ann nnA :TAC Tnn

nnTCSAtcnn nnAG CTag nn nnATC GATc nn nnTAG CTAc nn

nnTGG

nnACC

nnAGG CCTgg nn nnTCCGGAcc nn

CAgg in 3GTcc m

Jeśli (nieoczekiwanie) DNA nie został pocięty przez użyty przez Ciebie enzym restrykcyjny lub trawienie jest tylko częściowe, sprawdź, czy ten enzym nie jest wrażliwy na metylację!