8857685805

14 Biologia Molekularna Rośli

3. Badanieoddzialywań białek-drożdżowy system dwuhybrydowy

Drożdżowy system dwuhybrydowy (ang. Yeast Two Hybrid) służy do badania oddziaływań między dwoma potencjalnymi partnerami białkowymi. W technice tej wykorzystuje się fakt, że wiele eukariotycznych czynników transkrypcyjnych zawiera dwie funkcjonalnie niezależne domeny. Jedna z nich wiąże się z DNA (BD, ang. Binding Domain), druga natomiast aktywuje transkrypcję danego genu (AD, ang. Activation Domain). Obie te domeny są zatem niezbędne aby nastąpiła transkrypcja określonego genu.

W drożdżowym systemie dwuhybrydowym każda z tych domen zostaje połączona z jednym z potencjalnych i będących przedmiotem badań, partnerów białkowych. W efekcie powstają dwa tzw. białka fuzyjne: jedno z nich związane z domeną wiążącą się z DNA (BD), drugie zaś z domeną aktywującą transkrypcję (AD). Geny kodujące oba te fuzyjne białka znajdują się na dwóch różnych plazmidach. Plazmidy te wprowadza się do komórek drożdży, zatem oba białka podlegają ekspresji w tej samej komórce. Jeżeli badane białka oddziałują ze sobą, obie domeny: aktywująca transkrypcję (AD) i wiążąca się z DNA (BD), zbliżają się do siebie na tyle blisko, by móc aktywować transkrypcję konkretnego genu. W opisywanym układzie genem, który ulega transkrypcji jest jeden z genów reporterowych, np. gen kodujący p-galaktozydazę (lac-Z) lub HIS3.

Na zajęciach będziemy sprawdzać oddziaływanie w systemie dwuhybrydowym pomiędzy dwoma jądrowymi białkami roślinnymi: AtSWDB i FCA. Metoda dwuhybrydowa, która zostanie zastosowana na ćwiczeniach polega na wykorzystaniu dwudomenowej struktury białka, aktywatora GAL-4. Aktywator ten składa się z domeny aktywującej transkrypcję genu i z domeny wiążącej się do rejonu promotorowego - UAS genu GAL 1. Genem reporterowym jest lacZ. Używane są dwa wektory, które po wprowadzeniu do komórek

drożdży dają dwa fuzyjne białka:

•    pGAD424 zawierający domenę aktywującą (AD) i sekwencję kodującą białko FCA oraz

•    pGBT9 zawierający domenę wiążącą się z DNA (BD) i sekwencję kodującą drugie białko AtSWDB.

Jeśli białko X oddziałuje z białkiem Y, gen reporterowy kodujący P-galaktozydazę ulegnie transkrypcji (rys. 1). Wówczas aktywne białko P-galaktozydazy w obecności podanego z zewnątrz substratu, którym jest X-gal (5-bromo-4-chloro-3 -i ndol ilo-p-D-gal aktopiranozy d) przeprowadzi reakcję, w wyniku której powstanie niebieski produkt.

AtSWDB

U Arabidopsis thaliana istnieje mała rodzina genów posiadająca sekwencje homologiczne do drożdżowego genu SWI3, kodującego ważną podjednostkę dużego kompleksu przebudowującego (remodelującego) chromatynę ySWI/SNF. W roślinach występują cztery białka typu ySWI3: AtSWDA, AtSWDB, AtSWDC oraz AtSWDD. Białka te zawierają charakterystyczne motywy wysoko konserwowane we wszystkich czterech białkach, a także w drożdżowym SWI3. Białko AtSWI3B jest eksprymowane we wszystkich organach Arabidopsis thaliana, jest białkiem jądrowym oraz komplementuje mutację swego homologa w drożdżach.

FCA

FCA (Flowering Time Control Protein from A. thaliana) jest silnym aktywatorem wejścia rośliny w fazę kwitnienia. Zawiera dwie domeny wiążące RNA i domenę WW odpowiedzialną za wiązanie białko-białko. Transkrypt FCA podlega altenatywnemu składaniu (ang. splicing), w związku z czym w komórce mogą występować cztery warianty transkrypcyjne tego genu.

transkrypcja

UAS    promotor

Gen reporterowy LAC Z albo HIS3

Rys. 1 Schemat działania drożdżowego systemu dwuchybrydowego.