8857685807

16 Biologia Molekularna Rośli

Wykonanie (około 45 minut)

1.    Przygotować bufor A, składający się z 320 |xl PEG, 40 pl Li AC oraz 40 pl DTT (bufor A należy

^ przygotować tuż przed transformacja).DTT jest 5% substancja szkodliwą, należy pracować w rękawiczkach!

2.    Zebrać sterylną wykałaczką po około 1 mm⁵ drożdży (szczep Y190) z powierzchni pożywki stałej do 4 probówek Eppendorfa (1,5 ml) (drożdże hodowane w temperaturze 30°C przez 2-3 dni w pożywce YPG)

3.    Zawiesić drożdże w każdej z probówek w 80 pl buforu A.

4.    Do każdej probówki dodać po 5 pl nośnikowego DNA (ang. carrier DNA). Nośnikowy DNA należy trzymać w lodzie.

5.    Do probówki:

-    nr 1 dodać 5 pl (ok. 300 ng) plazmidowego DNAAtSWI3B/pGBT9 (kontrola negatywna testu dwuhybrydowego)

-    nr 2 dodać 5 pl plazmidu FCA/pGAD424

(kontrola negatywna testu dwuhybrydowego)

-    nr 3 dodać po 5 pl obu preparatów plazmidowego DNA (AtSWI3B/pGBT9 oraz FCA/pGAD424)

-    nr 4 dodać 5 pl plazmidu pLC 1 (kontrola

pozytywna testu dwuhybrydowego).

6.    Wszystkie otrzymane mieszaniny inkubować w bloku grzejnym lub łaźni wodnej w temperaturze 45°C przez 30 min

7.    Całość przenieść na szalki:

-    mieszaninę zawierającą plazmid AtSWI3B/ pGBT9 na szalkę WO-trp

-    mieszaninę zawierającą plazmid FCA/ pGAD424 na szalkę WO-leu

-    mieszaninę zawierającą oba plazmidy na szalkę WO-trp-leu

-    mieszaninę zawierającą plazmid pLCl na szalkę WO-leu

8.    Mieszaniny transformacyjne delikatnie rozprowadzić głaszczką po całej powierzchni szalek.

9.    Drożdże na szalkach hodować przez 2-3 dni w cieplarce w temperaturze 30°C (do momentu pojawienia się białych kolonii).

Tydzień 2

Dzień 1. Przygotowanie do wykonania testu dwuhybrydowego

Materiały:

-    Szalki WO-trp-leu, WO-trp, WO-leu

-    Sterylne wykałaczki

-    Palnik

-    Zapalarka lub zapałki

Wykonanie: (około 15 minut)

1.    Pobrać sterylną wykałaczką po kolei pojedyncze białe kolonie z szalek

-    WO-trp-leu (podwójne transformanty),

-    WO-leu (drożdże transformowane plamidem pLC 1 lub plazmidem pGAD424 zawierającym sekwencję FCA),

-    WO-trp (drożdże transformowane plazmidem pGBT9)

i przenieść je na nowe szalki WO-trp-leu, WO-leu, WO-trp, rozprowadzić je po niewielkiej powierzchni szalki (kilka cm²).

2.    Szalki inkubować przez 2-3 dni w 30°C. Tydzień 3

Dzień 1. Test dwuhybrydowy

Zamrożenie komórek drożdży w ciekłym azocie, a następnie ich rozmrożenie powoduje uszkodzenie i uwolnienie białek na zewnątrz komórek. Jeśli dwaj potencjalni partnerzy białkowi oddziałują ze sobą, to przyłączone do nich domeny, tj. domena wiążąca się z DNA (BD) oraz domena aktywująca transkrypcję (AD), zbliżają się do siebie i wówczas następuje ekspresja genu P-galaktozydazy. Po dodaniu do roztworu substratu dla P-galaktozydazy, którym jest X-gal, dochodzi do hydrolizy wiązania p-D-galaktozydowego. Jednym z produktów tej reakcji jest niebieski 5-bromo-4-chloro-3-indol. Produkt taki, a zatem także i niebieskie zabarwienie, świadczy o tym, że oba badane białka oddziałują ze sobą. Brak zabarwienie będzie dowodem tego, że oddziaływania takie nie zachodzą.

Jak zostało to już wcześniej wspomniane, należy wykonać kontrole zarówno pozytywne, jak i negatywne. Kontrolą negatywną są drożdże transformowane pojedynczymi plazmidami, zaś pozytywną drożdże stransformowane plazmidem pLCl.