WEKTOR PO AACINIE ZNACZY PRZEWOyNIK. http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/biotech/biotech3.html WEKTOR PO AACINIE ZNACZY PRZEWOyNIK. WEKTOR - cz膮steczka DNA mog膮ca by膰 no艣nikiem interesuj膮cego nas kawa艂ka DNA , kt贸ra posiada zdolno艣膰 do autonomicznej replikacji w danym typie kom贸rek. Zapewnia powielanie wprowadzonego fragmentu DNA czyli klonowanie a czasami tak偶e wydajn膮 synt ez臋 kodowanego przez gen bia艂ka (transkrypcj臋 i translacj臋 oraz jego stabilno艣膰) jak to ma miejsce w tzw. wektorach ekspresyjnych. S膮 r贸偶ne typy wektor贸w a dobranie odpowiedniego zale偶y m.in. od tego w jakich kom贸rkach zamierzamy klonowa膰 gen. Najwa偶niejszym elementem warunkuj膮cym specyficzno艣膰 wektora s膮 sekwencje odpowiedzialne za inicjacj臋 replikacji tzw. sekwencje ori. Najprostsze wektory posiada艂y wy艂膮cznie jedno , unikalne miejsce restrykcyjne , w kt贸re mo偶na by艂o wprowa dzi膰 obcy DNA. Obecnie najcz臋艣ciej jest to tzw. polilinker - syntetyczny odcinek DNA , w kt贸rym znajduje si臋 zwykle kilkana艣cie miejsc rozpoznawanych przez r贸偶ne restryktazy. Pozwala to na swobodniejszy dob贸r odpowiedniego do klonowania enzymu. Wektory zazwyczaj posiadaj膮 r贸wnie偶 geny markerowe czyli geny koduj膮ce bia艂ka odpowiedzialne za 艂atwo wyr贸偶nialne cechy fenotypowe. Wektor mus i by膰 tak skonstruowany aby istnia艂a mo偶liwo艣膰 selekcji tych kom贸rek , do kt贸rych wnikn膮艂. Jego budowa powinna pozwala膰 tak偶e na odr贸偶nienie wektora zrekombinowanego od takiego , kt贸ry zamkn膮艂 si臋 bez ligacji z fragmentem DNA. WEKTORY PLAZMIDOWE BAKTERYJNE. Budowa - niedu偶e , koliste cz膮steczki DNA zawieraj膮ce ori replikacji , gen markera selekcyjnego (najcz臋艣ciej oporno艣膰 na antybiotyk) oraz miejsce do klonowania. Wektory plazmidowe wprowadzane s膮 do kom贸rek bakterii przy wykorzystaniu zjawiska transformacji. W przypadku stosowanej najcz臋艣ciej bakterii - E.coli wymaga to zwi臋kszenia przepuszczalno艣ci b艂on kom贸rkowych czyli ukompetentnienia. W tym c elu wystawia si臋 kom贸rki na wysok膮 koncentracj臋 pewnych dwuwarto艣ciowych kation贸w. W typowej procedurze kom贸rki traktuje si臋 1 z 10 2010-04-04 13:31 WEKTOR PO AACINIE ZNACZY PRZEWOyNIK. http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/biotech/biotech3.html roztworem chlorku wapnia. Zazwyczaj 1 kom贸rka na milion zostaje stransformowana. 1 cz膮steczka na tysi膮c zrekombinowanych plazmid贸w transformuje kom贸rk臋 bakteryjn膮. Ka偶da kompetentna kom贸rka inkorporuje tylko jeden plazmid. Selekcj臋 zazwyczaj uzyskuje si臋 na dwa sposoby. Pierwszy z nich to obecno艣膰 w plazmidzie dw贸ch gen贸w oporno艣ci na dwa r贸偶ne antybiotyki przy czym w j ednym z nich znajduje si臋 miejsce do klonowania. Kom贸rka , kt贸ra nie pobra艂a plazmidu b臋dzie wra偶liwa na obydwa antybiotyki , taka , kt贸ra pobra艂a plazmid niezrekombinowany b臋dzie oporna na obydwa. Kom贸rka , kt贸ra ma plazmid z fragmentem obcego DNA b臋dzie wra偶liwa na antybiotyk , w kt贸rego genie by艂o miejsce restrykcyjne , poniewa偶 ci膮g艂o艣膰 genu zostanie przerwana co unieczynni produkowane bia艂ko. Drugi spos贸b to system selekcji opieraj膮cy si臋 na tzw. te艣cie alfa-komplementacji. Polilinkery wi臋kszo艣ci wek tor贸w umiejscowione s膮 w obr臋bie genu koduj膮cego a peptyd b-galaktozydazy. Transformowane s膮 bakterie , kt贸re maj膮 mutacj臋 akurat we fragmencie genu koduj膮cym t膮 cz臋艣膰 enzymu. Umo偶liwia to selekcj臋 na odpowiedniej po偶ywce bakterii , kt贸re pobra艂y zrekombi nowany plazmid poniewa偶 tylko one b臋d膮 bia艂e w odr贸偶nieniu od tych , w kt贸rych zasz艂a komplementacja mutacji i sprawny enzym rozk艂ada substrat dodany w po偶ywce co powoduje niebieskie zabarwienie kolonii. Pojedyncze kom贸rki bakteryjne , utworz膮 kolonie a wszystkie plazmidy w takiej kolonii b臋d膮 pochodzi艂y od jednego plazmidu wprowadzonego do kom贸rki , kt贸ra t膮 koloni臋 za艂o偶y艂a. Powstanie wi臋c klon a fragment DNA na plazmidzie to sklonowany DNA. 2 z 10 2010-04-04 13:31 WEKTOR PO AACINIE ZNACZY PRZEWOyNIK. http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/biotech/biotech3.html Pojemno艣膰 wektor贸w plazmidowych ograniczona jest sposobem wprowadzania rekombinacyjnych cz膮stek DNA do kom贸rek gospodarza. Przy klasycznej transformacji wielko艣膰 wstawki nie powinna by膰 wi臋ksza ni偶 oko艂o 10 kb. Warto zwr贸ci膰 jeszcze uwag臋 na ilo艣膰 kopii wektora w kom贸rce. Istniej膮 wektory niskokopijne i wysokokopijne co uzale偶nione jest od rodzaju ori. 3 z 10 2010-04-04 13:31 WEKTOR PO AACINIE ZNACZY PRZEWOyNIK. http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/biotech/biotech3.html Klonowanie w wektorze plazmidowym polega na przeci臋ciu go stosownym enzymem restrykcyjnym , defosforylacji jego ko艅c贸w w celu wyeliminowania mo偶liwo艣ci recyrkularyzacji samego wektora oraz ligacji , kt贸r膮 to reakcj臋 przeprowadza ligaza DNA tworz 膮ca standardowe wi膮zanie fosfodiestrowe , z odpowiednio wcze艣niej przygotowanymi fragmentami DNA , kt贸re chcemy sklonowa膰 , poci臋tymi t膮 sam膮 restryktaz膮 lub daj膮c膮 komplementarne ko艅ce. WEKTORY POCHODNE BAKTERIOFAG脫W : LAMBDOWE - pochodne faga l. Mo偶na w nich klonowa膰 wi臋ksze fragmenty DNA. Inn膮 zalet膮 jest wy偶sza wydajno艣膰 infekcji cz膮stkami bakteriofag贸w w por贸wnaniu do wydajno艣ci transformacji. Budowa : 4 z 10 2010-04-04 13:31 WEKTOR PO AACINIE ZNACZY PRZEWOyNIK. http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/biotech/biotech3.html odpowiednio zmodyfikowany bakt eriofag l. Wprowadzono mutacje punktowe w niekt贸rych genach zmieniaj膮ce w艂a艣ciwo艣ci ich produkt贸w : kr贸tkie delecje oraz niekiedy usuni臋cie 艣rodkowego regionu DNA odpowiedzialnego za cykl lizogenny. Z DNA faga mo偶na usun膮膰 oko艂o 30% genomu pozostawiaj膮c j ego lewe i prawe rami臋 zawieraj膮ce wszystkie geny niezb臋dne w cyklu litycznym. Dzi臋ki 12 nukleotydowym , wzajemnie komplementarnym , jednoniciowym fragmentom DNA na ko艅cach cz膮steczki DNA faga - tzw. sekwencjom cos - mo偶liwe jest przybranie przez D NA faga w kom贸rce bakteryjnej formy kolistej oraz zapakowanie go w bia艂kow膮 g艂贸wk臋. R贸wnie偶 w te wektory wstawione s膮 polilinkery , geny markerowe , silne promotory i inne. S膮 dwa rodzaje wektor贸w lambdowych , co spowodowane jest faktem , 偶e do bia艂kowej g艂贸wki pakowane jest DNA d艂ugo艣ci 75% do 105% d艂ugo艣ci DNA faga typu dzikiego : replacement - tak skonstruowane , 偶e centralny region jest oflankowany identycznym zestawem miejsc restrykcyjnych tak , 偶e przeci臋cie dan膮 restryktaz膮 wycina ten region z wektora. Na jego miejsce mo偶e by膰 wstawiony obcy DNA d艂ugo艣ci 9-25 kb. Klonow anie polega na izolacji poszczeg贸lnych ramion po wyci臋ciu regionu centralnego i ligacji ze zdefosforylowanymi fragmentami obcego DNA (co uniemo偶liwia wstawienie dw贸ch r贸偶nych odcink贸w DNA do jednego wektora) w warunkach sprzyjaj膮cych tworzeniu konkata mer贸w , nast臋pnie pakowaniu in vitro w kapsydy faga i infekcji kom贸rek E.coli. 5 z 10 2010-04-04 13:31 WEKTOR PO AACINIE ZNACZY PRZEWOyNIK. http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/biotech/biotech3.html insercyjne - zawieraj膮ce drobne modyfikacje dzikiego genomu faga. Odcinek obcego DNA musi zawiera膰 si臋 w granicach od 0 do 8 kb. Klonowanie polega na przeci臋ciu odpowiednim enzymem restrykcyjnym w miejscu do klonowania , izolacji poszczeg贸lnych ramion i ligacji z fragmentami DNA w warunkach umo偶liwiaj膮cych tworzenie konkatamer贸w , pakowaniu w kapsydy faga i infekcji E.coli. Wprowadzanie do kom贸rek gospodarza odbywa si臋 z wysok膮 efektywno艣ci膮 - z regu艂y 1 na 20 cz膮steczek zrekombinowanego wektora jest efektywnie pakowana w kapsyd i wprowadzana do kom贸rek E.coli na drodze transfekcji. POCHODNE FAGA M13 - szczeg贸lny cykl 偶yciowy tego faga pozwala na wykorzystanie go do wytwarzania jednoniciowego DNA czyli kiedy chodzi np. o sekwencjonowanie DNA lub ukierunkowan膮 mutagenez臋. KOSMIDOWE - stosowane do klonowania du偶ych fragment贸w DNA np. operon贸w prokariotycznych czy gen贸w eukariotycznych. Budowa : s膮 to zmodyfikowane plazmidy zawieraj膮ce sekwencj臋 cos faga l konieczn膮 przy pakowaniu DNA do kapsyd贸w fago wych. Najprostsze kosmidy zawieraj膮 ori repilkacji , gen markera selekcyjnego , miejsce do klonowania oraz sekwencj臋 cos. Modyfikacje tego typu wektor贸w polegaj膮 na zwi臋kszaniu ilo艣ci miejsc do klonowania (polilinkery) , wprowadzaniu element 贸w umo偶liwiaj膮cych analiz臋 klonowanego DNA np. promotor贸w fag贸w T3 , T7 itp. , wprowadzeniu element贸w umo偶liwiaj膮cych propagacj臋 wektora w kom贸rkach eukariotycznych tj. ori eukariotyczne , gen markera selekcyjnego dla kom贸rek eukariotycznych oraz w prowadzeniu drugiej sekwencji cos. 6 z 10 2010-04-04 13:31 WEKTOR PO AACINIE ZNACZY PRZEWOyNIK. http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/biotech/biotech3.html Wprowadzanie rekombinowanych cz膮steczek wektora jest podobne do infekcji fagowej. DNA wektora zligowanego z odpowiedniej wielko艣ci fragmentami obcego DNA jest in vitro pakowany w kapsydy faga a nast臋pnie wprowadzany do kom贸rek gospodarza na drodze transdukcji. Tam kosmidy zachowuj膮 si臋 jak plazmidy. Pojemno艣膰 takiego wektora jest ograniczona obustronnie. Klonowany DNA musi by膰 wielko艣ci od 35 do 45 kb poniewa偶 do kapsydu mo偶e zosta膰 wprowadzo ny DNA nie mniejszy ni偶 38 kb i nie wi臋kszy ni偶 52 kb. Tak wi臋c proces pakowania wymaga powstania uk艂adu dw贸ch sekwencji cos na jednej cz膮steczce DNA oddalonych od siebie o 38 do 52 kb. Osi膮ga si臋 to albo tn膮c wektor odpowiedni膮 restryktaz膮 i defos forylowany liguj膮c z odpowiedniej wielko艣ci fragmentami obcego DNA przy wysokim st臋偶eniu DNA i nadmiarze wektora (9:1) co sprzyja powstawaniu konkatamer贸w albo gdy wektor zawiera dwie sekwencje cos , rozcina si臋 go w dw贸ch miejscach : w miejscu do klonowania i mi臋dzy sekwencjami cos , nast臋pnie liguje si臋 go ze zdefosforylowanymi 7 z 10 2010-04-04 13:31 WEKTOR PO AACINIE ZNACZY PRZEWOyNIK. http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/biotech/biotech3.html fragmentami obcego DNA przy wysokim st臋偶eniu ATP co powoduje , 偶e 艂膮czenie t臋pych ko艅c贸w jest bardzo ma艂o wydajne a wi臋c g艂贸wnym produktem reakcji jest obcy DNA po艂 膮czony z fragmentami wektora. WEKTORY DRO呕D呕OWE. Dro偶d偶e jako kom贸rki gospodarzy posiadaj膮 niezaprzeczalne zalety : maj膮 struktury kom贸rkowe typowe dla eukariota , geny w nich klonowane mog膮 zawiera膰 sekwencje intronowe , proces obr贸bki mRNA jest zbli偶ony do tego , kt贸ry wys t臋puje u wy偶szych eukariont贸w , bia艂ka podlegaj膮 modyfikacjom posttranslacyjnym. Wynika z tego , 偶e klonowa膰 DNA w dro偶d偶ach nale偶y wtedy gdy zale偶y nam na uzyskaniu ekspresji badanego genu w kom贸rce eukariotycznej i odpowiednio zmodyfikowanych bia艂kowych produkt贸w. Wyst臋puj膮 dwa typy tych wektor贸w : replikatywne - gdy ori pochodzi z chromosom贸w dro偶d偶y (tzw. sekwencja ars) lub episomalne - gdy ori pochodzi z naturalnie wyst臋puj膮cego u dro偶d偶y plazmidu 2 m. Poza tym wektory te posiadaj膮 geny markerowe oraz polilinkery. Mog膮 to by膰 wektory bifunkcjonalne (wahad艂owe) czyli maj膮ce odr臋bne miejsca startu replikacji i geny markerowe dla kom贸rek dro偶d偶owych jak i bakteryjnych np. E.coli co umo偶liwia m.in. klonowanie gen贸w w kom贸rkach bakteryjnych a badanie ich ekspr esji w dro偶d偶ach. Skonstruowano r贸wnie偶 sztuczne chromosomy dro偶d偶owe czyli YAC. Istnieje mo偶liwo艣膰 klonowania w nich bardzo du偶ych fragment贸w DNA do 500 kb. YAC posiada sekwencje , kt贸re umo偶liwiaj膮 replikacj臋 naturalnych chromosom贸w czyli ars oraz zapewniaj膮 se gregacj臋 podczas podzia艂u - sekwencje telomerowe i centromerowe , ponadto znajduj膮 si臋 tam geny markerowe i polilinkery. INNE WEKTORY. WEKTORY POCHODNE WIRUSA SV40 (Simian Virus) - zbudowane z 500 bp fragmentu DNA wirusa zawieraj膮cego ori , promotory gen贸w koduj膮cych wczesne bia艂ka wirusa a tak偶e sekwencje regulacyjne odpowiedzialne za aktywacj臋 transkrypcji z tych prom otor贸w przez kom贸rkowe czynniki transkrypcyjne. U偶ywany do klonowania w kom贸rkach ssaczych. WEKTORY POCHODNE RETROWIRUS脫W - stosuje si臋 je w tzw. bezpiecznych uk艂adach z艂o偶onych. Pierwszy sk艂adnik to dwuniciowe DNA z sekwencjami LTR (long terminal repeats - d艂ugie ko艅cowe powt贸rzenia) , pe艂ni膮cymi funkcj臋 promotor贸w gen贸w wirusa i niezb臋d ne do integracji DNA wirusa z chromosomem gospodarza oraz z sekwencji psi warunkuj膮cej pakowanie kwasu nukleinowego do kapsydu. Drugi sk艂adnik to linia kom贸rek z prowirusem pozbawionym sekwencji psi a posiadaj膮cym geny koduj膮ce bia艂ka otoczk i wirusa i odwrotn膮 transkryptaz臋. Klonowanie w kom贸rkach ssaczych przeprowadza si臋 w ten spos贸b , 偶e DNA retrowirusa z w艂膮czonym do niego obcym genem wprowadza si臋 do specjalnej linii kom贸rkowej , w kt贸rej produkt jego transkrypcji pakowany jest w otoczk i bia艂kowe , izoluje si臋 je i infekuje nimi kom贸rki docelowe. Tu nast臋puje przepisanie z RNA na DNA , kt贸ry w艂膮czany jest do chromosomu co daje pocz膮tek transformowanej linii kom贸rkowej. WEKTORY POCHODNE BAKULOWIRUS脫W - wektor skonstruowany zosta艂 z sekwencji bakteryjnych ori i genu oporno艣ci na antybiotyk a tak偶e kasety ekspresyjnej , w sk艂ad kt贸rej w chodzi polilinker i sekwencje regulacyjne genu polihedryny bakulowirus a czyli promotor i terminator. Kom贸rki owad贸w lub ca艂e larwy transfekuje si臋 mieszanin膮 DNA bakulowirusa i zlinearyzowanego wektora 8 z 10 2010-04-04 13:31 WEKTOR PO AACINIE ZNACZY PRZEWOyNIK. http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/biotech/biotech3.html nios膮cego zrekombinowany gen i gen markerowy umo偶liwiaj膮cy selekcj臋 w kom贸rkach owad贸w. Wewn膮trz kom贸rki dochodzi do homolo gicznej rekombinacji i utworzenia zrekombinowanego wirusa , kt贸ry zamiast genu polihedryny ma gen , kt贸ry chcemy sklonowa膰. Dochodzi tu do prawid艂owych modyfikacji posttranslacyjnych klonowanych bia艂ek. Wydajno艣膰 produkcji jest do艣膰 niska a koszt stosunko wo wysoki. Znajduj膮 one zastosowanie przy produkcji odczynnik贸w analitycznych , diagnostycznych i niekt贸rych lek贸w. WEKTORY POCHODNE ADENOWIRUS脫W - w cyklu rozwojowym wprowadzaj膮 wiele kopii DNA do kom贸rki. Informacja genetyczna ulega ekspresji ale nie ulega replikacji poniewa偶 znajduje si臋 poza DNA gospodarza. W kolejnych pokoleniach kom贸rek wprowadzonego DN A jest coraz mniej. Wprowadzane odcinki DNA nie mog膮 by膰 zbyt d艂ugie. Stosowany do klonowania w kom贸rkach ssaczych. WEKTORY EKSPRESYJNE : Zawieraj膮 odpowiednio usytuowany silny promotor umo偶liwiaj膮cy ekspresj臋 na wysokim poziomie bia艂ka , kt贸rego gen znajduje si臋 na tym wektorze. 1. Plazmidowe wektory ekspresyjne zawieraj膮ce silne , regulowane promotory. Taki silny , regulowany promotor powoduje , 偶e w specyficznych warunkach transkrypcja jest inicjowana wiele razy na minut臋. Przyk艂adem mo偶e by膰 promotor laktozowy. Transkrypcj臋 wzmaga si臋 przez dodanie do po偶ywki IPTG (analog laktozy). 2. Plazmidowe wektory ekspresyjne zawieraj膮ce promotor p贸znych bia艂ek faga T7. Promotor genu RNA polimerazy faga T7 to specyficzna sekwencja 23 bp. System ten jest do艣膰 skomplikowany. Sk艂ada si臋 z dw贸ch element贸w. W zrekombinowanych kom贸rkach E.coli , zawieraj膮cych gen koduj膮cy T7 RNA polimeraz臋 wstawiony za promotorem laktozowym zachodzi synteza du偶ej ilo艣ci RNA polimerazy gdy do po偶ywki dodane jest IPTG. Kom贸rki te s膮 transformowane wektorem plazmidowym , kt贸ry niesie kopi臋 promotora T7 i cDNA genu koduj膮cego wybrane bia艂ko. RNA polimeraza wi膮偶e si臋 z promotorem T7 na wektorze plazmidowym co katalizuje transkrypcj臋 wstawionego cDNA. 3. Istniej膮 tak偶e eukariotyczne systemy ekspresyjne. Jest to szczeg贸lnie istotne gdy chcemy otrzyma膰 aktywne bia艂ko , w kt贸rym prawid艂owo zosta艂y przeprowadzone modyfikacje posttranslacyjne. Maksymalna wielko艣膰 DNA , kt贸ry mo偶e by膰 sklonowany w wektorach. 9 z 10 2010-04-04 13:31 WEKTOR PO AACINIE ZNACZY PRZEWOyNIK. http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/biotech/biotech3.html Typ wektora D艂ugo艣膰 klonowanego DNA (kb Plazmid 10 25 Bakteriofag l Kosmid 45 YAC 500 ENZYMY , KT脫RE TN DNA NA FRAGMENTY I ACZ JE POZWALAJC NA NIEZLICZON ILO艢膯 KOMBINACJI TYCH呕E. SCREENING BANKU GEN脫W CZYLI IDENTYFIKACJA ODPOWIEDNIEGO KLONU. SZUKANIE IGAY W STOGU SIANA ? (c) 1997, 1998 Biologia Molekularna w Internecie Webmaster 10 z 10 2010-04-04 13:31