ROZDZIAA
PIERWSZY: LABORATORIUM
MIKROBIOLOGICZNE. PODSTAWY ASEPTYKI
WST
P TEORETYCZNY
1. ZASADY BHP
1.1. OGÓLNE ZASADY BHP DOTYCZ
CE PRACY W LABORATORIUM
1. Do laboratorium nie wolno wnosić odzieży wierzchniej.
2. W czasie pracy należy używać adekwatnej odzieży ochronnej (fartuch, okulary
ochronne, rękawiczki). Zaleca się także odpowiedni, wygodny strój i obuwie
(należy unikać butów na wysokim obcasie). Długie włosy powinny być związane.
3. W pracowni i korytarzu nie wolno biegać, jeść, pić, żuć gumy i palić, a po
zakończeniu ćwiczeń dokładnie umyć i osuszyć ręce.
4. Studentom nie wolno przebywać w laboratorium bez opieki prowadzącego bądz

innej upoważnionej osoby.
5. W razie jakichkolwiek wątpliwości dotyczących wykonywanego ćwiczenia, należy
konsultować się z prowadzącym zajęcia.
6. Nie wolno wykonywać eksperymentów i prac nie wchodzących w zakres ćwiczeń.
7. Na stołach laboratoryjnych mogą znajdować się tylko przedmioty niezbędne do
realizacji doświadczeń.
8. Przed przystąpieniem do pracy pod dygestorium należy sprawdzić czy działa
wyciÄ…g.
9. Przed zapaleniem palnika gazowego należy sprawdzić, czy wąż jest starannie
nałożony na kurek i palnik gazowy oraz czy wąż gumowy nie jest uszkodzony.
10. Nie wolno używać naczyń uszkodzonych (pękniętych lub nadtłuczonych).
11. Szkło przeznaczone do ogrzewania w płomieniu musi być na zewnętrznej
powierzchni suche, by nie uległo pęknięciu.
12. Nie wolno nachylać się nad naczyniami podczas ich ogrzewania.
13. W czasie ogrzewania cieczy w probówce nie wolno jej wylotu kierować ani na
siebie, ani na sąsiadów.
14. Naczynia, które mają być ogrzewane albo mają się podczas zachodzących reakcji
rozgrzewać, lub w których wywiązują się gazy, nie mogą być szczelnie zamykane.
15. Probówki bezpośrednio ogrzewane płomieniem należy trzymać za pomocą
drewnianych Å‚ap do ogrzewania. A
apa musi obejmować probówkę możliwe jak
najbliżej jej wylotu, aby uniknąć zapalenia łapy.
16. Ogrzewając ciecz w probówce nad palnikiem należy trzymać probówkę pod
kątem, który pozwala na ogrzewanie jak największej powierzchni cieczy a nie dna
probówki. Wylot probówki kierujemy w miejsce, w którym nie przybywają ludzie.
W czasie ogrzewania, ciecz w probówce delikatnie mieszamy. Probówkę usuwamy
z płomienia w momencie, w którym pojawia się pierwszy objaw wrzenia (pęcherz
gazu) i po chwili ponownie wkładamy do pojawienia się kolejnego pęcherza gazu.
Czynność powtarzamy raz lub dwa razy.
17. Ogrzewając w probówce ciała stałe, zawartości probówki nie mieszamy.
18. Wprowadzając do probówki przynajmniej dwie substancje, z których chociaż
jedna jest w stanie ciekłym zawartość probówki dokładnie mieszamy przez
intensywne wstrząsanie, chyba że procedura doświadczenia wskazuje inne
postępowanie.
19. Palnych cieczy nie wolno ogrzewać nad płomieniem.
20. Pojemniki z odczynnikami muszą być zamykane i odkładane zawsze na swoje
miejsce.
21. Nie wolno próbować smaku odczynników ani preparatów wydanych do zajęć.
22. Nie należy wąchać nieznanych substancji wprost z naczyń. Albo wącha się
najpierw korek, albo wachlującym ruchem ręki skierowuje się powietrze z parami
badanej substancji do nosa.
23. Substancji chemicznych (zwłaszcza nieznanych) nie wolno dotykać rękoma. Do
nabierania odczynników, czy badanych próbek należy używać łyżeczki (szpatułki).
24. Nie wolno wlewać stężonych kwasów i zasad do rozgrzanych cieczy lub naczyń.
25. Nie wolno wlewać stężonego kwasu siarkowego do płynów bez uprzedniego
upewnienia się, że płyn nie jest alkaliczny. Przy rozcieńczaniu kwasów, a przede
wszystkim kwasu siarkowego, należy wlewać ZAWSZE kwas do wody wąskim
strumieniem, przy ciągłym mieszaniu. Czynności z kwasami należy wykonywać
pod dygestorium z szybą opuszczoną na wysokość łokci.
26. Z takimi substancjami jak: brom, chlor, chlorowodór, siarkowodór, tlenki
azotu, stężone kwasy, lotne rozpuszczalniki organiczne pracować należy
pod dygestorium z szybą opuszczoną do wysokości łokci.
27. Należy zwracać szczególną uwagę podczas pracy z takimi substancjami jak:
fenol, alkaloidy, sole metali ciężkich.
28. Przeprowadzanie reakcji, odparowywanie cieczy oraz wszystkie czynności, w
czasie których wywiązują się pary i gazy, wolno wykonywać tylko pod wyciągiem.
29. Wszystkie czynności ze stężonym kwasem fluorowodorowym należy wykonywać
w rękawicach gumowych i okularach ochronnych.
30. Przy czynnościach z silnymi truciznami, należy utrzymywać w szczególnej
czystości ręce, stół i używane przyrządy w pracy, aby wykluczyć możliwość
zatrucia.
31. Wszelkie przypadki rozbicia szkła, rozlania odczynnika, uszkodzenia sprzętu,
skaleczenia, poparzenia lub innego rodzaju kontaktu z odczynnikiem
chemicznym, pogorszenia samopoczucia itp. należy natychmiast zgłosić
prowadzÄ…cemu.
32. Nie wolno pozostawiać pracującej aparatury bez nadzoru.
33. Po umyciu naczyń laboratoryjnych należy je odłożyć do wysuszenia w miejsce do
tego przeznaczone.
34. Przed opuszczeniem sali ćwiczeń należy sprawdzić czy wszystkie używane
urządzenia zostały prawidłowo wyłączone, szkło umyte a miejsce pracy
uporzÄ…dkowane.
35. Bez zgody prowadzącego zajęcia do pracowni nie wolno wprowadzać osób
trzecich ani jej opuszczać (z wyjątkiem sytuacji niezbędnych do ratowania życia i
zdrowia).
1.2. DODATKOWE ZASADY BHP DOTYCZ
CE PRACY W LABORATORIUM
MIKROBIOLOGICZNYM
1. Przed rozpoczęciem i po zakończeniu pracy, zalecane jest przemycie stanowiska
pracy środkiem dezynfekcyjnym.
2. Szkło i inne przedmioty wielorazowego użytku należy składować w czasie ćwiczeń
w wyznaczonym miejscu a na końcu dokładnie umyć według wskazówek
prowadzącego. Przedmioty jednokrotnego użytku umieścić w przeznaczonym do
tego pojemniku.
3. Drobny sprzęt metalowy (igły, ezy itp.) sterylizować na bieżąco w płomieniu
palnika.
4. Płytki, kolby i inne naczynia zawierające hodowle bakteryjne powinny być cały
czas zamknięte. Otwierać je można tylko jałowo, w celu pobrania materiału i
możliwie na krótki czas.
5. Po zakończeniu pracy z mikroskopem należy natychmiast zetrzeć olejek
immersyjny z obiektywu za pomocą bawełnianej szmatki lub chusteczki
nasÄ…czonej alkoholem albo benzynÄ….
2. WYPOSAŻENIE LABORATORIUM MIKROBIOLOGICZNEGO
Współczesna mikrobiologia posługuje się różnymi metodami badań drobnoustrojów.
Wśród nich są metody cytologiczne, serologiczne, chemiczne, immunochemiczne,
biochemiczne i genetyczne. Z tego też powodu laboratorium mikrobiologiczne powinno
składać się z kilku pomieszczeń o różnym przeznaczeniu, aczkolwiek ilość i jakość tych
pomieszczeń powinna być dostosowana do indywidualnych potrzeb danej pracowni.
Oprócz właściwej pracowni, w której prowadzi się obserwacje i badania drobnoustrojów
lub zajęcia edukacyjne, duże laboratoria posiadają także: boks do pracy jałowej,
pracownię chemiczną, pokój wagowy wraz z aparaturą precyzyjną, pokój wirówkowy,
cieplarnię i chłodnię oraz pomieszczenia składające się na zaplecze: zmywalnię,
sterylizatornię i pożywkarnię. Bardzo duże laboratoria mikrobiologiczne dysponują także
zwierzętarniami zlokalizowanymi na zewnątrz budynku głównego. Mniejsze laboratoria
zwykle organizuje się w formie  skompaktowanej , co w zupełności wystarcza na
skromniejsze potrzeby. Boks do pracy jałowej zastępuje się komorą laminarną,
zapewniającą pracę w jałowym środowisku dzięki wmontowanej lampie UV i przy stałym
pionowym lub poziomym przepływie powietrza przez filtr mikrobiologiczny. Pracownię
chemiczną ogranicza się do tzw. przygotowalni, czyli małego pomieszczenia, gdzie
przygotowywane i przechowywane są odczynniki chemiczne, często także pożywki. Wagi,
wirówki i urządzenia służące do sterylizacji mogą być w różnej konfiguracji zlokalizowane
na sali ćwiczeń (pracowni) lub w przygotowalni. Osobne pomieszczenie chłodnicze
zastępowane jest lodówkami i zamrażarkami zlokalizowanymi j.w. Cieplarnia zaś to
pomieszczenie, w którym utrzymuje się stałą, podwyższoną temperaturę sprzyjającą
wzrostowi drobnoustrojów (zwykle okoÅ‚o 30 °C). W cieplarni prowadzi siÄ™ hodowle
mikroorganizmów. W przypadku braku takiego pomieszczenia stosuje się cieplarki, zwane
też szafami termostatycznymi lub termostatami. Są to urządzenia przypominające
lodówki, ale pracujÄ…ce w wyższym zakresie temperaturowym (zwykle 4 50 °C).
Stanowiska do mycia również najczęściej zlokalizowane są w pracowni głównej. Zlewy
powinny być kwasoodporne.
Okna pracowni mikrobiologicznej powinny wychodzić na stronę północną lub mieć
zainstalowane elementy chroniące przed bezpośrednim promieniowaniem słonecznym.
Ściany, podłogi i stoły laboratoryjne powinny być łatwo zmywalne i łatwe do dezynfekcji,
niepalne i o ile to możliwe, odporne na plamy. Szafy, szafki, krzesła i inne meble powinny
być łatwe do utrzymania w czystości. W laboratorium musi znajdować się dygestorium
(wyciąg) służący do pracy z bardziej niebezpiecznymi substancjami, wydzielającymi
opary lub nieprzyjemną woń itp. Pracownia musi być także wyposażona w sprawnie
funkcjonujÄ…cy system wentylacji. Mile widziane sÄ… czujniki gazu, dymu itp.
Na standardowym stanowisku pracy mikrobiologa powinien znajdować się palnik gazowy
(o ile możliwe z regulowaną wysokością płomienia), statyw z ezami, zestaw
podstawowych odczynników i standardowe szkło laboratoryjne, wanienki do barwienia
preparatów a także mikroskop świetlny z możliwością zastosowania immersji (czasem
umieszczany na oddzielnym stole lub w zamkniętej szafce). Oprócz wymienionych
wcześniej urządzeń w laboratorium powinna się także znajdować destylarka, autoklaw,
aparat Kocha, suszarka elektryczna, Å‚az
nia wodna (umożliwia utrzymanie stałej
temperatury) lub Å‚az
nia mikrobiologiczna (z uchwytami pozwalajÄ…cymi na wytrzÄ…sanie
hodowli płynnych, w celu ich stałego napowietrzania), pipety automatyczne, pompa
próżniowa, pH-metr, szafa na szkło laboratoryjne, pojemniki na zużyte materiały
jednorazowe i kosze na rozbite szkło. W zależności od indywidualnego profilu i potrzeb
danego laboratorium, jego wyposażenie może być znacznie bardziej rozbudowane.
Szkło stosowane w trakcie ćwiczeń, które obejmuje niniejszy skrypt, nie wymaga
specjalnego traktowania (jest to konieczne w przypadku pracy z groz
nymi
mikroorganizmami). Szkło laboratoryjne myje się woda wodociągową z użyciem takich
samych środków czystości i detergentów, jakich używa się w domu. Umyte szkło należy
obficie przepłukać bieżącą wodą a następnie wodą destylowaną. Jeżeli czas na to pozwala
szkło można suszyć na wolnym powietrzu a w razie potrzeby  w suszarce elektrycznej,
w temperaturze 60 °C.
Podstawowe szkło laboratoryjne obejmuje zlewki (z podziałką lub bez), kolby stożkowe
(zwane także erlenmajerkami) z wąską lub szeroką szyjką, kolby okrągło- i płaskodenne,
cylindry miarowe, pipety szklane, bagietki, lejki, butelki z ciemnego lub bezbarwnego
szkła z doszlifowanym korkiem i inne (rysunek 1.1). Typowo mikrobiologicznymi
przyrządami są głaszczki i ezy.
Głaszczka to cienka, najczęściej szklana pałeczka wygięta w charakterystyczny sposób,
służąca do równomiernego rozprowadzania materiału biologicznego po powierzchni
pożywki stałej.
Eza to cienki, najczęściej platynowy drucik zakończony oczkiem lub haczykiem,
umieszczony w oprawie. Eza służy do przenoszenia materiały biologicznego na pożywkę,
robienia rozmazów na szkiełku podstawowym itp. Dość często w mikrobiologii stosuje się
też tzw. ezy kłute, czyli po prostu igły w oprawce, które służą do zaszczepiania podłoży
stałych poprzez wkłucie. W laboratoriach mikrobiologicznych używa się także ez
plastikowych, które są jednorazowego użytku (rysunek 1.1).
Do hodowli bakterii na podłożach stałych wykorzystuje się szalki Petriego (rysunek 1.1),
czyli okrągłe płaskie naczynia szklane z wieczkiem. W mikrobiologii używa się także pęset
(metalowych lub plastikowych) oraz specjalnych drewnianych uchwytów do szkiełek
mikroskopowych, przypominajÄ…cych klamerki do prania, wykorzystywanych przede
wszystkim w trakcie barwienia preparatów.
Rys. 1.1 Podstawowe szkło laboratoryjne (A  zlewka z podziałką, B  kolba stożkowa z wąską szyjką, C 
cylinder miarowy, D  probówka, E  butelka z doszlifowanym korkiem, F  głaszczka szklana, G  bagietka
szklana, H  ezy: z oczkiem i haczykiem, I  szalka Petriego)
3. PODSTAWY ASEPTYKI
Ponieważ przedmiotem badań mikrobiologii są organizmy najczęściej tak małe, że
niemożliwe do zauważenia gołym okiem, a jednocześnie stanowiące potencjalne
niebezpieczeństwo zarówno dla samego badacza jak i jego otoczenia, niezbędnym w
mikrobiologii jest zawsze przestrzeganie aseptyki. Pojęcie to najogólniej oznacza
wszystkie czynności mające na celu zapobieganie zakażeniom i skażeniom
drobnoustrojami. Zakażenie dotyczy organizmów żywych, skażenie odnosi się do
elementów nieożywionych, zarówno będących naturalnymi komponentami środowiska,
jak i wytworami organizmów żywych w tym człowieka. Aseptyka wspiera się na dwóch
filarach: sterylizacji i dezynfekcji.
3.1. STERYLIZACJA (WYJAA
AWIANIE)
Sterylizacją lub inaczej wyjaławianiem nazywamy proces zabijania wszystkich form
żywych drobnoustrojów, zarówno form wegetatywnych, jak i przetrwalnikowych.
Sterylizacja niszczy również wirusy. Postępowanie to ma szczególne znaczenie tam, gdzie
należy posługiwać się jałowym sprzętem i pracować w jałowym otoczeniu. Sterylne
warunki pracy powinny być więc zachowane m. in. w szpitalach, na salach operacyjnych i
gabinetach zabiegowych, przy produkcji niektórych leków, płynów infuzyjnych,
preparatów krwiopochodnych, środków opatrunkowych oraz sztucznych elementów
organów (protez). W laboratorium mikrobiologicznym sterylizacji poddaje się naczynia
przeznaczone na pożywki oraz same pożywki, drobny sprzęt, narzędzia, szkło
laboratoryjne a także zużyte hodowle, materiał biologiczny pochodzący od chorych oraz
wszelkie materiały mogące być z
ródłem zakażenia. Sterylizację można przeprowadzać na
kilka sposobów stosując metody fizyczne, mechaniczne i chemiczne.
3.1.1. METODY FIZYCZNE
Fizyczne metody sterylizacji w zależności od stosowanego czynnika podzielić można na
trzy duże grupy:
" oparte na wysokiej temperaturze;
" oparte na innych rodzajach promieniowania elektromagnetycznego (np.
promieniowaniu UV, mikrofalach, promieniowaniu rentgenowskim);
" oparte na zastosowaniu ultradz
więków.
3.1.1.1 METODY TEMPERATUROWE
Wytrzymałość bakterii na sterylizację temperaturową jest różna. W celu określenia
wrażliwości mikroorganizmów na temperaturę stosuje się pojęcie punktu śmierci
cieplnej oraz czasu śmierci cieplnej. Punktem śmierci cieplnej określa się najniższą
temperaturę, w której ginie dany organizm w ciągu 10 minut. Czas potrzebny do zabicia
wszystkich mikroorganizmów danego gatunku w określonej temperaturze to czas śmierci
cieplnej.
Sterylizacja cieplna sucha
Wyżarzanie. Sterylizacja przez wyżarzanie w płomieniu palnika gazowego służy do
wyjaławiania drobnego sprzętu metalowego, np. ezy, igieł preparacyjnych, łopatek,
skalpeli itp. Niszczenie drobnoustrojów, polegające na ich spaleniu, jest stosowane przed
i po szczepieniu pożywki za pomocą ezy. Aby sterylizacja ezy była efektywna, należy
rozgrzać drucik do czerwoności a następnie koniecznie jałowo ostudzić np. przez
zanurzenie w jałowej pożywce płynnej lub kilkukrotne dotknięcie pożywki stałej lub
powierzchni jałowego szkła.
Opalanie. Metodę tą można zastosować w przypadku przedmiotów niepalnych. Opalanie
w płomieniu palnika brzegów probówek lub kolb (po wyjęciu korka) stosuje się w celu
zapobieżenia zakażeniu wnętrza naczynia. W płomieniu można opalać też bagietki,
głaszczki szklane oraz szkiełka podstawowe do preparatów mikroskopowych. Przedmioty
te, a także skalpele, łopatki metalowe, pęsety, grube igły preparacyjne sterylizuje się
również przez zanurzenie w alkoholu etylowym i opalenie w płomieniu palnika gazowego.
Opalanie jest podstawowym sposobem zachowania sterylności w trakcie rozlewania
pożywek.
Wyjaławianie gorącym suchym powietrzem. Sterylizację suchym gorącym
powietrzem przeprowadza się w suszarkach elektrycznych i służy ona do wyjaławiania
szkła laboratoryjnego a także trwałych materiałów lub przedmiotów stalowych, np. opraw
metalowych do filtrów, cylinderków do badania wrażliwości na antybiotyki, kuleczek
szklanych oraz materiałów sypkich itp. Sterylizację tą metodą wykonuje się w suszarkach
w temperaturze 140 °C przez 2,5 h, 160 °C przez 2 h lub 180 °C przez 1 h.
Sterylizacja cieplna mokra (parÄ… wodnÄ…)
Tyndalizacja (pasteryzacja frakcjonowana). Proces ten przeprowadza siÄ™ w aparacie
Kocha (rysunek 1.2). Aparat ten służy do sterylizacji w bieżącej parze wodnej podłoży
mikrobiologicznych, których skład nie pozwala na wyjaławianie w temperaturze powyżej
100 °C. Jest to zamykany pokrywÄ… kocioÅ‚ z podwójnym dnem, którego spód stanowi
zbiornik z wodÄ…, podgrzewanÄ… do temperatury wrzenia. GorÄ…ca para wodna ulatnia siÄ™
przez dziurkowane dno zbiornika, nad którym ustawia się sterylizowane przedmioty,
krąży wewnątrz zbiornika a na koniec uwalniana jest na zewnątrz. Ogrzewanie w
temperaturze 100 °C w ciÄ…gu 30 minut niszczy jedynie formy wegetatywne
drobnoustrojów. W celu pełnego wyjałowienia pożywek w aparacie Kocha przeprowadza
siÄ™ tzw. tyndalizacjÄ™ albo inaczej pasteryzacjÄ™ frakcjonowanÄ…. Jest to proces trzykrotnego
ogrzewania w temperaturze 100 °C przez 30 minut, w odstÄ™pach 24-godzinnych. W
przerwach miÄ™dzy ogrzewaniem podÅ‚oża umieszcza siÄ™ w cieplarce w temperaturze 32 °C.
Po pierwszym jałowieniu zostają zabite formy wegetatywne, pozostają zaś przetrwalniki,
które w czasie inkubacji pożywki w cieplarce przekształcają się w formy wegetatywne,
zabijane podczas drugiego ogrzewania. Trzecie ogrzewanie, również poprzedzone
inkubacjÄ… w temperaturze 32 °C, zapewnia peÅ‚nÄ… skuteczność metody.
Rys. 1.2 Schemat aparatu Kocha
Sterylizacja w autoklawie. Sterylizacja tą metodą pozwala uzyskać temperaturę
wyższÄ… niż 100 °C, dziÄ™ki zastosowaniu podwyższonego ciÅ›nienia (wiÄ™ksze ciÅ›nienie to
wyższa temperatura wrzenia wody). Schemat konstrukcji jest podobny, jak w przypadku
aparatu Kocha, tylko nieco bardziej skomplikowany. Sterylizacji za pomocÄ… pary wodnej
pod zwiększonym ciśnieniem możemy poddawać jedynie te materiały, pożywki lub płyny,
których skÅ‚adniki nie ulegajÄ… rozkÅ‚adowi w temperaturze powyżej 100 °C. DziaÅ‚anie
autoklawu polega na sterylizacji wysoką temperaturą uzyskaną po sprężeniu nasyconej
pary wodnej. Para ta w zetknięciu z chłodnymi wyjaławianymi przedmiotami skrapla się w
postaci wody, uwalniając dużą ilość utajonego ciepła kondensacji, które podnosi
temperaturę sterylizacji. Jest więc ona zależna od ciśnienia. Autoklaw musi być przed
zamknięciem całkowicie odpowietrzony, ponieważ poddanie sprężaniu mieszaniny pary
wodnej i powietrza powoduje uzyskanie niższej temperatury i w rezultacie obniża
efektywność sterylizacji. W praktyce stosuje się nadciśnienie od 0,8 do 1,6 atm (od 810,6
do 1621,2 HPa), co odpowiada temperaturze 117-127 °C. Na skuteczność sterylizacji ma
również wpływ czas  im wyższa temperatura sterylizacji, tym krótszy czas jałowienia.
Czas sterylizacji w autoklawie zależy od objętości pożywek w kolbach: im mniejsza ich
objętość, tym krótszy czas wyjaławiania. W podanych wyżej warunkach czas potrzebny
do zabicia wszystkich bakterii, zarówno komórek wegetatywnych jak i form
przetrwalnych, waha siÄ™ od 20-30 do 60 minut (rzadko). Standardowo stosuje siÄ™
nastÄ™pujÄ…ce kombinacje czasu i temperatury: 115 °C przez 35 minut, 121 °C przez 15-20
minut i 134 °C przez 4 minuty.
Niektóre materiały mogące ulec uszkodzeniu w czasie autoklawowania (np. narzędzia
chirurgiczne, plastikowe węże, wełniane koce) można sterylizować przy użyciu
mieszaniny pary wodnej i formaldehydu w niższej temperaturze (80 °C). W takich
warunkach przetrwalniki zabijane sÄ… w ciÄ…gu 2 godzin.
UWAGA !!! Aby uniknąć pęknięcia lub wybuchu zamkniętych naczyń zawierających
płyny, korki należy pozostawić niedokręcone oraz pozwolić schłodzić się sterylizowanym
pÅ‚ynom co najmniej do 80 °C.
Przyczyną śmierci komórek drobnoustrojów podczas sterylizacji są przede wszystkim
zmiany chemiczne w białkach (ich denaturacja) oraz zniszczenie struktury błony
komórkowej. W wysokiej temperaturze w środowisku suchym białka ulegają utlenieniu, w
środowisku zawierającym wodę białka koagulują. Ten ostatni proces jest powodowany
przez niższą temperaturę niż utlenianie białek. Należy pamiętać, że procesowi
wyjaławiania podlegają materiały i produkty zawierające nie pojedyncze komórki
drobnoustrojów, ale ich populacje. Działanie letalne wysokiej temperatury na taką
populację występuje w określonym czasie i w konkretnej temperaturze a o parametrach
decyduje punkt śmierci cieplnej oraz czas śmierci cieplnej, o czym pisano powyżej.
Warto również pamiętać, że efektywność sterylizacji zależy od wielkości sterylizowanego
produktu (kolby z podłożami, probówki z sola fizjologiczną), jego rodzaju (woda w kolbie,
konserwa mięsna) oraz ułożenia go w autoklawie. Czynniki te wpływają na szybkość
nagrzewania wyjaławianego materiału.
3.1.1.2. PROMIENIOWANIE ELEKTROMAGNETYCZNE
Promieniowanie elektromagnetyczne obejmuje zakres od ultrakrótkich promieni
kosmicznych, poprzez promienie X, UV, widzialną część światła słonecznego do
podczerwieni i długich fal radiowych. U podstaw działania każdego z tych rodzajów
promieniowania leży zjawisko jego pochłaniania przez substancje chemiczne komórki.
Pochłanianie to ma charakter wybiórczy i poszczególne związki chemiczne (np. DNA,
białka) absorbują promieniowanie o określonej długości fali. W zależności od dawki oraz
czasu działania promieniowania na drobnoustroje obserwuje się efekt mutagenny
(komórka ulega mutacji) lub letalny (zabójczy  śmierć komórki).
Najsłabiej na drobnoustroje działa światło widzialne, a wrażliwość na jego działanie
zwiększają barwniki: błękit metylenowy i eozyna  na bakterie Gram-dodatnie oraz
safranina  na bakterie Gram-ujemne. Bakteriobójcze działanie światła widzialnego w
obecności barwników jest związane ze zjawiskiem fotosensytyzacji (fotouczulenia).
Zjawisko to polega na przemianie pod wpływem promieniowania substancji
fotouczulającej w substancję toksyczną. Podobnie jak barwniki syntetyczne, mogą działać
substancje o charakterze barwników, wytwarzane w komórkach bakterii, np. koenzymy z
grupą porfirynową. Najsilniejsze działanie w sterylizacji wykazuje promieniowanie UV
oraz promieniowanie jonizujÄ…ce.
Promieniowanie UV
Promieniowanie UV o zakresie fal 230-270 nm wykazuje bardzo silne działanie
bakteriobójcze lub mutagenne. Promieniowanie to jest pochłaniane w komórkach
bakteryjnych przez zasady purynowe i pirymidynowe DNA oraz aminokwasy aromatyczne
białek. Najbardziej wrażliwe na jego działanie są formy wegetatywne bakterii.
Przetrwalniki (tak endo- jak i egzospory) oraz wirusy sÄ… bardziej oporne.
Zmiany w komórkach bakterii pod wpływem promieniowania UV są różnorodne. Efekt
letalny warunkowany jest powstawaniem dimerów pomiędzy resztami tyminy, w tej
samej nici DNA, co prowadzi do zaburzenia jego replikacji. Działanie mutagenne związane
jest z tworzeniem się dimerów cytozyny oraz cytozyny i tyminy.
Bakterie wykształciły dwa mechanizmy umożliwiające im naprawę uszkodzonego DNA:
reperację świetlną (fotoreaktywacja) i reperację ciemną. Zjawisko fotoreaktywacji polega
na rozszczepieniu powstałych dimerów tyminy przy udziale enzymu fotoliazy
uaktywnianej światłem widzialnym. Reperacja ciemna obejmuje kilka działań 
rozpoznanie i wycięcie uszkodzonych fragmentów DNA,  wypełnienie usuniętego
fragmentu DNA nowym i połączenie nici w całość. Wegetatywne formy bakterii wykazują
różną wrażliwość na promieniowanie UV. Przetrwalniki i wirusy są od kilkunastu do
kilkudziesięciu razy bardziej oporne od form wegetatywnych na działanie UV, podczas
gdy zarodniki grzybów pleśniowych są kilka do kilkanaście tysięcy razy bardziej oporne
na działanie tego czynnika sterylizacji od ich form wegetatywnych.
Promieniowanie UV jest stosowane do sterylizacji powietrza, pomieszczeń (sale
operacyjne, gabinety zabiegowe, linie technologiczne np. do produkcji leków w
warunkach jałowych, boksy bakteriologiczne, wirusologiczne itp.), niekiedy także naczyń
laboratoryjnych wrażliwych na temperaturę. Jako z
ródło promieniowania stosuje się
lampy kwarcowe podwieszane pod sufitem. W podobne lampy wyposażone są laminary z
poziomym lub pionowym przepływem jałowego powietrza. Na efektywność procesu
wyjaławiania za pomocą UV ma wpływ m.in. stopień zanieczyszczenia powietrza
cząstkami mechanicznymi (tzw. zapylenie), jego wilgotność oraz czas napromieniowania.
Sterylizowane pomieszczenia powinny być czyste i odkażone. Promienie UV rozchodzą się
prostolinijnie, więc ich działanie jest jedynie powierzchniowe. Sterylizacja promieniami
UV różnych przedmiotów musi być poprzedzona ich dokładnym umyciem, osuszeniem i
odkażeniem wewnętrznym. Działanie promieni UV jest powierzchniowe, więc nie zawsze
jest możliwe wysterylizowanie wewnętrznej strony np. probówek. Ponadto jałowione
przedmioty należy odwracać, aby cała ich powierzchnia uległa sterylizacji. Pomimo
rozpowszechnienia lamp UV obecnie rezygnuje się z ich stosowania, gdyż powodują one
jonizację sterylizowanego powietrza, co ma niekorzystny wpływ na zdrowie ludzi.
Promieniowanie radiacyjne
Sterylizacja radiacyjna opiera się na niszczeniu drobnoustrojów za pomocą
promieniowania jonizującego (przenikliwego). Najsilniejsze działanie bakteriobójcze ma
promieniowanie X, gamma oraz katodowe (strumień szybkich elektronów). Działanie
promieniowania jonizujÄ…cego na bakterie opiera siÄ™ na 2 mechanizmach. Pierwszy z nich
wynika z bezpośredniego działania energii promieniowania na elementy komórki, w
szczególności DNA, co powoduje ich zniszczenie. Drugi mechanizm związany jest z
powstawaniem pod wpływem promieniowania wolnych rodników, czyli atomów lub
cząsteczek zawierających niesparowany elektron, co powoduje, że związki te są
niezwykle reaktywne. A
atwo wchodzą zatem w reakcje, w szczególności z cząsteczkami
zawierającymi wiązania podwójne, jak np. DNA, co prowadzi do ich niszczenia.
y
ródłem promieniowania wykorzystywanym na skalę przemysłową są izotopy
(praktycznie tylko kobalt  tzw.  lampy kobaltowe) oraz akceleratory ( przyspieszacze )
elektronów. Sterylizacji radiacyjnej poddaje się przede wszystkim sprzęt medyczny
jednorazowego użytku (np. strzykawki, igły, skalpele, cewniki, zestawy do przetaczania
krwi, zestawy do kroplówek, protezy itp.), materiały opatrunkowe, niektóre produkty
spożywcze, leki i surowce farmaceutyczne, artykuły kosmetyczne, korki do butelek od
wina, osady ściekowe i inne.
3.1.2. METODY MECHANICZNE (S
CZENIE)
Niektóre pożywki, bufory, płyny ustrojowe (np. surowice) i roztwory niektórych innych
substancji (np. kwaśnego węglanu sodu, antybiotyków) nie mogą być wyjałowione
termicznie, gdyż ich składniki ulegają zniszczeniu w wysokiej temperaturze. W takim
przypadku stosuje siÄ™ mechanicznÄ… metodÄ™ sterylizacji  sÄ…czenie (filtrowanie) przez
filtry o Å›rednicy porów mniejszej od Å›rednicy bakterii, najczęściej 0,2 i 0,45 µm. Przez tak
małe otwory w filtrze płyn przemieszcza się z trudem, w związku z tym należy stosować
podciśnienie (uzyskiwane za pomocą pompki wodnej lub pompki zasilanej elektrycznie)
albo nadciśnienie (w filtrach strzykawkowych  rysunek 1.3). Zestawy do sączenia muszą
być wcześniej wysterylizowane. Filtry mikrobiologiczne działają nie tylko na zasadzie sita
mechanicznego, ale także przez adsorpcję cząstek sączonych na ścianach porów.
Skuteczność sączenia mikrobiologicznego zależy nie tylko od wielkości bakterii, ale także
ich ładunku elektrycznego, budowy oraz powierzchni porów filtrów.
Rys. 1.3 Filtr strzykawkowy
Typowy zestaw do sączenia składa się z kolby próżniowej, w której umieszcza się filtr
bakteriologiczny. Całość zabezpiecza się przed kontaminacją drobnoustrojami z zewnątrz
i sterylizuje w autoklawie lub w suszarce. Zestaw podłącza się do pompy próżniowej,
najlepiej poprzedzonej płuczką. W przeszłości stosowano wiele odmian filtrów
mikrobiologicznych o różnym przeznaczeniu i wielkości (np. filtry porcelanowe,
azbestowe, szklane). DziÅ› sÄ…czenie mikrobiologiczne zdominowane jest przez filtry
membranowe, a ultrafiltracja za ich pomocą pozwala na oddzielenie z sączonego płynu
cząstek o bardzo małych rozmiarach. W praktyce mikrobiologicznej stosuje się sączki z
nitrocelulozy lub octanu celulozy. Ich zaletą jest to, że mogą być sterylizowane w
autoklawie (po umieszczeniu w wodzie). Obecnie używa się różnych zestawów do
sączenia bakterii za pomocą filtrów membranowych. Filtry membranowe są również
szeroko stosowane w oznaczaniu liczby drobnoustrojów w badanym materiale oraz przy
wyjaławianiu leków, a także w metodach służących wydzielaniu z hodowli toksyn,
enzymów lub innych produktów metabolizmu bakterii.
3.1.3. METODY CHEMICZNE
Metody chemiczne opierajÄ… siÄ™ na sterylizacji gazami. SterylizacjÄ™ gazowÄ… stosuje siÄ™ w
przemyśle do wyjaławiania produktów jednorazowego użytku, aparatury medycznej,
opatrunków, pościeli i odzieży szpitalnej, książek, tkanin, obrazów oraz suszy
warzywnych i owocowych. Jako gaz sterylizacyjny, najczęściej używany jest tlenek
etylenu  rozpuszczalny w wodzie cykliczny eter (C2H4O)  w mieszaninie z CO2
(zmniejsza to jego wybuchowość). Tlenek etylenu jest trucizną protoplazmatyczną
powodującą alkilację grup funkcyjnych białek (w szczególności grupy  SH). Główną wadą
tej metody jest jej wysoka toksyczność, co wymusza podwyższony stopień kontroli i
bezpieczeństwa, a to podnosi koszty procesu.
3.1.4. KONTROLA STERYLIZACJI
Kontrola skuteczności procesu sterylizacji jest sprawą kluczową. W przypadku sterylizacji
pożywek test skuteczności jałowienia przeprowadza się niejako samoistnie. Jeżeli
pożywka nie została dobrze wysterylizowana, to po kilku godzinach lub dniach pojawią
się w niej mikroorganizmy. Takiego  naocznego testu nie da się przeprowadzić w
przypadku szkła, drobnego sprzętu czy też pożywek, które zużywane są na bieżąco. W
kontroli sterylizacji stosuje siÄ™ jednÄ… z trzech metod, tj. fizycznÄ…, biologicznÄ… lub
chemicznÄ…. Fizyczna metoda kontroli sterylizacji to metoda oparta na kontroli
parametrów fizycznych procesu wyjaławiania, takich jak np. czas trwania, procesu,
temperatura, ciśnienie itp. W biologicznej metodzie kontroli sterylizacji dość powszechnie
stosuje się tzw. sporotesty. Są to krążki bibułowe zawierające zaadsorbowane
przetrwalniki bakterii (np. Bacillus subtilis lub Bacillus stearothermophilus). Taki preparat
umieszcza się w autoklawie, suszarce lub w wyjaławianym przedmiocie i poddaje
procesowi sterylizacji. Następnie krążek z przetrwalnikami jałowo przenosi się do
jałowego bulionu (pożywki) i inkubuje w odpowiedniej temperaturze przez 48 h. Wzrost
bakterii będzie świadczył o nieprawidłowym przebiegu procesu sterylizacji, co może
wynikać ze złej pracy urządzenia lub z nieodpowiedniego doboru parametrów procesu
(czasu i temperatury). Znacznie powszechniejszÄ… metodÄ… kontroli sterylizacji jest metoda
chemiczna. Opiera się ona o zmiany właściwości różnych związków chemicznych, zwykle
barwnych. Najpopularniejszym testem chemicznym jest test z taśmą do autoklawowania,
na której po poprawnie przeprowadzonym procesie pojawiają się czarne ukośne prążki.
Inny test opiera się na małych szklanych rurkach, w których zamknięty jest barwny płyn.
Rurki te wkłada się do urządzenia sterylizującego i przeprowadza proces. Zmiana koloru
płynu wewnątrz rurki potwierdza prawidłowość przebiegu procesu jałowienia.
3.2. DEZYNFEKCJA
Dezynfekcja to inaczej odkażanie i prowadzi do zniszczenia drobnoustrojów
chorobotwórczych i potencjalnie chorobotwórczych oraz zmniejszenia zanieczyszczenia
innymi drobnoustrojami. Do dezynfekcji stosuje się głównie środki chemiczne i
temperaturÄ™. W praktyce niszczy ona jedynie formy wegetatywne bakterii, w
przeciwieństwie do sterylizacji, która niszczy zarówno formy wegetatywne jak i
przetrwalnikowe. Metodami dezynfekcji opartymi na wysokiej temperaturze sÄ…:
dekoktacja (gotowanie) i pasteryzacja.
3.2.1. METODY TEMPERATUROWE
3.2.1.1. DEKOKTACJA (GOTOWANIE)
W przeszłości powszechnie stosowano ogrzewanie w temperaturze wrzenia wody
strzykawek, igieł iniekcyjnych, instrumentów chirurgicznych, filtrów membranowych w
szczelnie zamkniętych sterylizatorach elektrycznych lub zwykłych, podgrzewanych na
maszynkach elektrycznych lub nad płomieniem palnika gazowego. Posługując się tą
metodą należy pamiętać o stosowaniu wody destylowanej (w szczególnych warunkach
można użyć wody przegotowanej), gdyż gotowanie w wodzie wodociągowej pozostawia
nalot na strzykawkach bÄ…dz
wewnątrz igieł.
3.2.1.2. PASTERYZACJA
Pasteryzacja jest to proces niszczenia form wegetatywnych drobnoustrojów obecnych w
środowisku płynnym, np. w produktach spożywczych: mleku i jego przetworach, piwie,
sokach owocowych itp. Pasteryzacja ma na celu zabicie bakterii chorobotwórczych w
produktach spożywczych oraz przedłużenie trwałości tych produktów w wyniku
zniszczenia większości drobnoustrojów saprofitycznych nieprzetrwalnikujących, przy
jednoczesnym zachowaniu walorów smakowych produktu. Klasyczna pasteryzacja polega
na ogrzewaniu produktu do temperatury 70 °C (ale nie wiÄ™cej niż 100 °C) przez kilka
minut. Metoda UHT (ultra high temperature pressing) stosowana do konserwacji mleka
polega na bÅ‚yskawicznym (1-2 s) podgrzaniu do temperatury 135-150 °C i
natychmiastowym schłodzeniu do temperatury pokojowej. Wystarcza to, aby zabić
większość drobnoustrojów i jednocześnie nie powoduje np. rozkładu białek mleka, co
prowadzi do jego gorzknienia.
Niektórzy autorzy zaliczają dekoktację i pasteryzację do metod sterylizacyjnych, głównie
ze względu na wykorzystywany czynnik sterylizacyjny, jakim jest temperatura, częściowo
też ze względów historycznych. Nie jest to jednak pogląd w pełni uzasadniony.
Z pojęciem dezynfekcji wiążą się także inne terminy: sanityzacja, antyseptyka i
konserwacja. Nie opierają się one na działaniu wysokiej temperatury.
Konserwacja to hamowanie wzrostu i rozmnażania drobnoustrojów za pomocą
schładzania i/lub środków konserwujących oraz podwyższonego ciśnienia osmotycznego.
Sanityzacja jest to mycie za pomocą detergentów pomieszczeń oraz ich wyposażenia,
narażonych na silne zanieczyszczenie drobnoustrojami. Pomieszczenia te to przede
wszystkim sale i korytarze szpitalne, Å‚azienki, ubikacje itp.
Antyseptyka to postępowanie prowadzące do usuwania drobnoustrojów ze skóry, błon
śluzowych, uszkodzonych tkanek itp., czyli ogólnie dotyczy żywych tkanek. Do
antyseptyki stosuje się, z powodów oczywistych, jedynie nietoksyczne środki
dezynfekcyjne, które zabijają drobnoustroje, nie uszkadzając i nie podrażniając
jednocześnie tkanek. Antyseptykę stosuje się profilaktycznie (zapobieganie zakażeniom)
lub terapeutycznie (leczenie infekcji).
3.2.2. CHEMICZNE ÅšRODKI DEZYNFEKCYJNE
Spektrum stosowanych w praktyce środków dezynfekcyjnych jest dość duże. Szerokie
zastosowanie danego środka dezynfekcyjnego wiąże się z jego odpowiednimi
właściwościami. Dobry środek dezynfekcyjny powinien być skuteczny, działać na
drobnoustroje w niewielkim stężeniu, w krótkim czasie i w temperaturze otoczenia. Nie
powinien wpływać ujemnie na żywność ani niszczyć dezynfekowanych przedmiotów i
urządzeń. Środki dezynfekcyjne nie mogą stanowić zagrożenia dla ludzi, powinny się
także łatwo spłukiwać wodą. Mile widziany jest również brak nieprzyjemnego zapachu,
szerokie spektrum działania oraz dobra cena.
Na efektywność działania środka dezynfekcyjnego może pływać wiele czynników, jak np.
czas, temperatura, pH, wilgotność środowiska, czy obecność substancji organicznej w
otoczeniu.
3.2.2.1. KWASY I ZASADY
Efekt ich działania wiąże się z aktywnością jonów wodorowych bądz
wodorotlenowych,
przy czym kwasy wywierają silniejszy wpływ na drobnoustroje niż zasady. Jednakże
obydwa rodzaje związków wykazują silne działanie zarówno wobec form wegetatywnych,
jak i przetrwanych mikroorganizmów. Ich wadą jest natomiast to, że niszczą nie tylko
drobnoustroje, ale i dezynfekowane przedmioty. 10 % roztwory zasad używane są do
dezynfekcji magazynów żywności i pomieszczeń po zwierzętach dotkniętych chorobami
wirusowymi. 20 % zawiesinÄ™ wodorotlenku wapnia (tzw. mleko wapienne) stosuje siÄ™ do
dezynfekcji pomieszczeń, wagonów przeznaczonych do transportu zwierząt, toalet,
śmietników itp. Wodorotlenek sodu (NaOH) jest składnikiem środków do udrażniania rur.
Mocne kwasy nieorganiczne, takie jak np. HCl, H2SO4 są bardziej skuteczne niż kwasy
organiczne. Spośród kwasów organicznych w dezynfekcji zastosowanie znalazł kwas
nadoctowy CH3COOOH, który w niskich stężeniach działa silnie utleniająco (dzięki
obecności ugrupowania nadtlenkowego: -O-O-). W stężeniach 0,25-2,5 % jest
wykorzystywany do dezynfekcji przedmiotów z tworzyw sztucznych i porcelany.
3.2.2.2. ÅšRODKI UTLENIAJ
CE
Najważniejsze miejsce wśród nich zajmują związki chloru a w praktyce chloraminy
organiczne i podchloryny (HOCl), najczęściej sodu lub wapnia. Związki te stosuje się do
dezynfekcji rąk (w stężeniach 0,5-1 %) lub pomieszczeń (5 %). Lepiej działają w
środowiskach kwaśnych i wykazują silniejsze działanie wobec bakterii Gram-ujemnych niż
Gram-dodatnich, słabiej działają na formy przetrwalne. Związki te aktywne są jedynie w
środowisku wolnym od białek i ich pochodnych, gdyż cząsteczki te reagują z chlorem, nie
pozwalajÄ…c na utworzenie kwasu podchlorowego niszczÄ…cego bakterie.
Do dezynfekcji wody stosuje siÄ™ chlor w postaci gazowej. Reaguje on z wodÄ… tworzÄ…c
kwas podchlorowy (HOCl), który jest silnym czynnikiem utleniającym. Bardzo silnym
utleniaczem stosowanym do dezynfekcji wody jest też ozon (O3). Wykazuje on silne
działanie wobec bakterii i wirusów, utlenia też niektóre zanieczyszczenia chemiczne wód,
jak np. fenole. Jest łatwo usuwalny z wody, gdyż sam się rozkłada. Obok chloru jest
coraz chętniej stosowany do dezynfekcji wód wodociągowych.
Do środków utleniających stosowanych w praktyce zaliczamy też nadmanganian
potasowy (KMnO4) oraz wodę utlenioną (H2O2), która do celów dezynfekcyjnych
wykorzystywana jest w stężeniu 3 %.
3.2.2.3. ALKOHOLE
Aktywność bakteriobójcza alkoholi wzrasta wraz z długością łańcucha węglowego
cząsteczki. Najczęściej stosowanymi w celach dezynfekcyjnych alkoholami są etanol i
propanol, także metanol, który z tych trzech działa najsłabiej. Alkohole powodują
denaturację białek bakteryjnych w środowisku wodnym oraz rozpuszczanie lipidów.
Propanolu używa się w stężeniu 80 %, jednak nie do celów dezynfekcji osobistej,
ponieważ wykazuje silne działanie alergizujące. Etanol najlepiej działa w stężeniu 70 %.
3.2.2.4. ALDEHYDY
Najsilniejsze działanie bakteriobójcze wykazuje aldehyd mrówkowy (HCHO), zwany także
formaldehydem. Aldehydy powodują alkilację białek, reagują z grupami  NH2, -SH i 
COOH. Preparatem handlowym aldehydu mrówkowego jest formalina, która zawiera 37
% tego związku oraz 10-15 % metanolu, który zapobiega polimeryzacji aldehydu
mrówkowego. Formalinę stosuje się przede wszystkim do utrwalania preparatów
tkankowych i okazów, także do wypalania brodawek, natomiast w celach
dezynfekcyjnych przygotowuje się wodny lub alkoholowy roztwór formaliny o stężeniu 3-
20 %.
3.2.2.5. ZWI
ZKI FENOLU I ICH POCHODNE
Fenol to alkohol powstały przez dołączenie grupy wodorotlenowej do aromatycznej
cząsteczki benzenu (rysunek 1.4). Fenole powodują denaturację białek i rozrywanie błon
komórkowych. Związki fenolu mają silne działanie bakteriobójcze, słabsze wobec form
przetrwalnych i wirusów. Środowisko kwaśne wzmacnia działanie fenoli i ich pochodnych,
osłabia je natomiast obecność w środowisku substancji organicznych, zwłaszcza białek.
Krajowe preparaty stosowane w praktyce to lizol, septyl i desson. Zwłaszcza lizol miał
kiedyś dość duże zastosowanie, obecnie jest coraz rzadszy ze względu na nieprzyjemny
zapach i działanie żrące na skórę.
Rys. 1.4 Wzór strukturalny fenolu
3.2.2.6. DETERGENTY
Detergenty to inaczej środki powierzchniowo czynne. Są to związki chemiczne
posiadające w cząsteczce długi łańcuch hydrofobowy oraz grupę polarną (hydrofilową).
Cząsteczki detergentów gromadzą się na granicy faz, zmniejszając napięcie
powierzchniowe rozpuszczalnika, co w praktyce wykorzystuje siÄ™ w celu Å‚atwiejszego
usuwania brudu z różnych powierzchni, w szczególności do rozpuszczania tłuszczu. Ze
względu na charakter chemiczny grupy polarnej rozróżnia się detergenty anionowe
(sulfoniany alkilowe -SO3Na, estry alkilowe kwasu fosforowego -OPO3), detergenty
kationowe (aminy alifatyczne) oraz detergenty niejonowe. Powierzchnia komórki
bakteryjnej jest naładowana ujemnie, co ułatwia adsorpcję detergentu kationowego.
Detergent ten powoduje zmianę przepuszczalności ściany i błony komórkowej bakterii a
w efekcie śmierć komórki. Detergenty działają lepiej wobec bakterii Gram-dodatnich niż
Gram-ujemnych, są również aktywne wobec drożdży. Wadą tych związków jest to, że
mikroorganizmy dość szybko się na nie uodparniają.
3.2.2.7. JODOFORY
SÄ… to koloidalne roztwory jodu w zwiÄ…zkach powierzchniowo czynnych lub polimerach
spełniających rolę nośników. Ich aktywność opiera się na uwalnianiu jodu, który jest
zabójczy dla bakterii. Jod inaktywuje białka poprzez reakcję z jednym z aminokwasów 
tyrozyną. Do dezynfekcji ran powszechnie stosuje się jodynę, czyli 3 % roztwór jodu w
etanolu, z dodatkiem jodku potasu (KI), jako środka stabilizującego. Podobnym
roztworem jest używany w laboratoriach do różnych zastosowań płyn Lugola, czyli wodny
roztwór zawierający 1% jodu i 2% jodku potasu.
3.2.2.8. CHLORHEKSYDYNA
Chlorheksydyna (rysunek 1.5) to syntetyczny antyseptyk, stosowany w postaci
(dwu)glukonianu lub octanu. Działa silnie na bakterie Gram-dodatnie, natomiast słabiej
na Gram-ujemne. Jest używana głównie jako środek odkażający skórę, błony śluzowe,
rany oraz narzędzia chirurgiczne. Jest też np. składnikiem niektórych płynów do płukania
ust.
Rys. 1.5 Wzór strukturalny chlorheksydyny1
3.2.2.9. SOLE METALI CI
ŻKICH
W praktyce stosuje się sole rtęci i srebra, które działają silnie bakteriobójczo, ale tylko na
wegetatywne formy bakterii. Z punktu widzenia człowieka, bardziej zasadne jest
stosowanie soli srebra, które jest dla człowieka nieszkodliwe, w przeciwieństwie do
toksycznej rtęci. Różne związki srebra wykorzystuje się czasami przy produkcji odzieży,
kosmetyków (dezodoranty) i innych artykułów, co zmniejsza nieprzyjemny zapach potu
(zapach ten jest wynikiem rozwoju żyjących w pocie bakterii).
CZ
ŚĆ PRAKTYCZNA
1. PRZYGOTOWANIE SZKA
A LABORATORYJNEGO DO STERYLIZACJI
Umyte i wysuszone szkło laboratoryjne można sterylizować wysoką temperaturą na
sucho w suszarce elektrycznej. Pipety szklane, probówki, kolby, szalki Petriego itp.
przygotowuje się do sterylizacji w następujący sposób:
otwory pipet i probówek zatyka się tamponikami z waty i zabezpiecza kapturkiem
z folii aluminiowej osłaniającym korek z waty;
większe otwory, jak np. w przypadku kolb stożkowych, zatyka się dopasowanymi
korkami przygotowanymi z warty i gazy (opis ich przygotowania w kolejnym
punkcie) i zabezpiecza się kapturkiem z folii aluminiowej osłaniającym korek z
waty (można też stosować korki dostępne w handlu, wówczas stosowanie folii
aluminiowej nie jest konieczne);
szalki Petriego, pipety zamyka siÄ™ w specjalnych tubusach, lub owija szczelnie
papierem, np. gazetowym;
probówki lub kolby sterylizowane wraz z pożywką zabezpiecza się kapturkiem z
folii aluminiowej osłaniającym korek z waty.
SzkÅ‚o sterylizuje siÄ™ w suszarkach w temperaturze 140 °C przez 2,5 h, 160 °C przez 2 h
lub 170-180 °C przez 1 h. Ze wzglÄ™dów praktycznych najwyższych temperatur raczej siÄ™
unika i stosuje tylko w przypadku pośpiechu. W zbyt wysokiej temperaturze papier
kruszeje i wydziela nieprzyjemny zapach spalenizny. Po zakończeniu sterylizacji szkła nie
należy od razu wyciągać, gdyż gwałtowna zmiana temperatury może spowodować jego
pękanie.
Materiały: umyte i osuszone szkło laboratoryjne (ilość i rodzaj według polecenia
prowadzącego), papier gazetowy, wata kosmetyczna, korki (sposób ich przygotowania
podano w kolejnym punkcie), folia aluminiowa
1. Przygotować odpowiednią ilość i rodzaj szkła laboratoryjnego według polecenia
prowadzącego zajęcia. W razie potrzeby szkło najpierw dokładnie umyć i
osuszyć.
1
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/5/5b/Chlorhexidine.png, na licencji GNU
2. Suche szkło przygotować do sterylizacji według wskazówek podanych powyżej.
3. Przygotowane szkło ułożyć w suszarce, ustawić odpowiednią temperaturę i czas
trwania procesu.
4. Po zakończeniu procesu sterylizacji odczekać kilkadziesiąt minut aż szkło nieco
ostygnie i wyciągnąć z suszarki. Wysterylizowanego szkła nie należy
rozpakowywać! Jest to dopuszczalne tylko bezpośrednio przed jego użyciem.
5. Sterylne szkło odłożyć w miejsce wskazane przez prowadzącego lub użyć w
doświadczeniu.
2. KONTROLA STERYLNOÅšCI PODA
OŻY WYLEWANYCH W SPOSÓB
JAA
OWY I NIEJAA
OWY
Materiały: sterylna i niesterylna szalka Petriego, sterylna i niesterylna probówka, pisak
do szkła, agar odżywczy, bulion odżywczy
1. Przygotować po dwie szalki Petriego i dwie probówki (jałową i niejałową).
Odpowiednio opisać.
2. W obu szalkach umieścić pożywkę agarową. W jałowej zachowując warunki
sterylne, w niejałowej dbając tylko o sterylność pożywki (by móc ją wykorzystać
do innych doświadczeń).
3. W obu probówkach umieścić po około 2 ml jałowego bulionu. W jałowej w sposób
sterylny a w przypadku niejałowej dbając tylko o sterylność bulionu.
4. Szalki i probówki wstawić do cieplarki na 37 °C. Wyniki obserwować na kolejnych
zajęciach.
3. Dezynfekcja środkami chemicznymi i sterylizacja UV
1. 6 szalek Petriego napełnić pożywką agarową i oznaczyć nr od 1 do 6
2. pozostawić do zestalania agaru a następnie plastikową pipetą pobrać ok. 0,2 ml zawiesiny
E. coli, przepłukując uprzednio pipetę kilka razy zawiesiną bakterii
3. za pomocą głaszczki rozprowadzić zawiesinę po całej płytce kolistym ruchem i odczekać
około 5 minut
4. po tym czasie przechylić płytkę i w sytuacji gdyby na powierzchni agaru pozostał płyn
zebrać go tą sama pipetą i odrzucić do probówki
5. Następnie:
Szalkę nr 6 podzielić na 8 sektorów i ponumerować je od 1 do 8.
Krążki bibuły używając pęsety namoczyć kolejno roztworami 70% etanol, 3% woda
utleniona, 5% r-r nadmanganianu potasu, 2% jodyna, Rivanol, 5% r-r fenolu,
Domestos
Nasączone krążki bibuły umieszczać w oznaczonych sektorach wg tabeli
Nr sektora roztwór wynik
1 70% etanol
2 5% woda utleniona
3 5% r-r nadmanganianu potasu
4 2% jodyna
5 5% r-r fenolu
6 Rivanol
7 Domestos
8 kontrola
SzalkÄ™ umieÅ›cić na 24 godziny w temp. 37ÚC.
6. Pozostałe 5 szalek naświetlać promieniami UV w następujący sposób:
Szalka:
nr 1 10 s;
nr 2 30 s;
nr 3 1 min;
nr 4 5 min;
nr 5 10 min;
nr 6 0 min
7. NastÄ™pnie szalki umieÅ›cić na 24 godziny w temp. 37ÚC.
4. Naturalne środki bakteriobójcze (antybiotyki)
Materiały: sterylna szalka Petriego, głaszczka, sterylna igła lub eza, pisak do szkła, agar
odżywczy, hodowla bakteryjna, z
ródło antybiotyku (grzyb, promieniowiec, cebula, czosnek,
preparat farmaceutyczny)
1. Wlać w sposób sterylny pożywkę agarową na szalkę Petriego.
2. Posiać pipetą i równomiernie rozprowadzić głaszczką na powierzchni agaru, zawiesinę
bakterii testowych.
3. Na założonej hodowli bakteryjnej umieścić wskazane przez prowadzącego z
ródło
antybiotyku (zaszczepić sterylną igłą lub ezą w dowolnym miejscu szalki mikroorganizm
produkujący antybiotyk; położyć fragment cebuli, czosnku lub preparatu farmaceutycznego) a
następnie miejsce to oznaczyć pisakiem do szkła na spodniej części szalki.
4. Szalki opisać, wstawić do cieplarki na 37ÚC a wyniki odczytać na kolejnych zajÄ™ciach.