EKSPRESJA GENÓW KLONOWANYCH W WEKTORACH PLAZMIDOWYCH W ZREKOMBINOWANYCH SZCZEPACH E COLI(1)
Tom 51, 2002 Numer 3 (256) Strony 365 373 MARIAN SĘKTAS Katedra Mikrobiologii Uniwersytet Gdański Kładki 24, 80-822 Gdańsk e-mail: sektas@biotech.univ.gda.pl EKSPRESJA GENÓW KLONOWANYCH W WEKTORACH PLAZMIDOWYCH W ZREKOM- BINOWANYCH SZCZEPACH ESCHERICHIA COLI SYSTEMY EKSPRESJI GENÓW Praktyczne wykorzystanie wiedzy o struk- funkcjonalną całoSć, chociaż utworzony jest z turze i regulacji replikacji plazmidów bakteryj- fragmentów DNA pochodzących z różnorod- nych oraz budowie i funkcji promotorów, nych naturalnych xródeł, najczęSciej plazmido- gdzie inicjowany jest proces transkrypcji DNA, wego, wirusowego lub chromosomowego pozwoliło na konstrukcję technikami rekombi- DNA. Zasadniczym elementem struktury wek- nacji DNA in vitro, specjalnej klasy plazmidów tora ekspresyjnego jest efektywny i dobrze re- nazywanych wektorami ekspresyjnymi. Pla- gulowany promotor, pozwalający na bardzo zmid jako autonomicznie replikujący się no- wydajną transkrypcję, oraz rejon do klonowa- Snik klonowanego genu daje możliwoSć pod- nia genów złożony z rzadkich miejsc restryk- niesienia iloSci kopii danego genu (dawki cyjnych (ang. multiple cloning site, MCS). genu) oraz regulacji jego ekspresji, a ponadto UmiejętnoSć stosowania plazmidowych wek- ułatwia jego modyfikacje genetyczne. W efek- torów daje szereg korzySci m.in.: (i) ułatwienie cie otrzymujemy nadprodukcję białka stano- manipulowania i klonowania DNA, (ii) możli- wiącą kilka- do kilkudziesięciu procent wszyst- woSć usytuowania danego fragmentu DNA w kich białek komórkowych. Zazwyczaj wektory dowolnym otoczeniu genetycznym, (iii) utrzy- ekspresyjne wykorzystuje się do nadprodukcji mywanie minimalnego poziomu ekspresji ba- białek w odpowiednio dobranym pod wzglę- danego genu w stanie represji systemu, (iv) dem cech genetycznych szczepie gospodarza. szybką i prostą metodę indukcji ekspresji genu. Zapewnia on właSciwą kontrolę ekspresji Pomimo faktu, że nie każdy gen może ulegać genu. Wektor funkcjonujący w specyficznym wydajnej ekspresji w szczepach Escherichia gospodarzu stanowią łącznie system ekspresyj- coli, organizm ten jest nadal niezwykle użytecz- ny. Powszechne wykorzystywanie systemów ny w przedsięwzięciach biotechnologicznych ekspresyjnych przyczyniło się do znacznego ze względu na stosunkowo niewielkie wyma- podniesienia poziomu produkcji białek i wy- gania pokarmowe oraz niski koszt hodowli dajnoSci technik związanych z ich izolowa- (patrz str. 533 w PROTEIN EXPRESSION AND niem i oczyszczaniem (MAKRIDES 1996). Kon- PURIFICATION 2000). Najprostszy system eks- sekwencją tego jest istotne przySpieszenie ba- presyjny składa się z dwóch zasadniczych ele- dań nad rolą i właSciwoSciami białek. Budowa mentów: (1) wektora plazmidowego, zawie- wektorów oparta jest na różnego typu natural- rającego kontrolowany promotor i marker se- nych replikonach wraz z genami markerów lekcyjny, oraz (2) gospodarza bakteryjnego po- ułatwiającymi selekcję właSciwych klonów. siadającego fenotyp dostosowany do właSci- Plazmidowy wektor stanowi strukturalną i wego funkcjonowania wektora. 366 MARIAN SĘKTAS OPTYMALIZACJA SEKWENCJI KLONOWANYCH GENÓW Od wielu lat technologia nadprodukcji wirusowymi ma jeszcze dodatkowy cel. Ze białek obejmuje także proces optymalizacji se- względu na znaczne tempo transkrypcji pro- kwencji kodujących je genów, z uwzględnie- wadzonej np. przez polimerazę RNA T7, tran- niem rejonów promotorowego i terminatoro- skrypty genów posiadających słabe rejony wego transkrypcji. Wektory pozwalają na RBS ulegają często enzymatycznej degradacji, swobodną genetyczną manipulację genem co prowadzi do drastycznego obniżenia po- (np. miejscowo-specyficzną mutagenezę) i ziomu ekspresji (IOST i współaut. 1992). Dzie- jego wszechstronną analizę. Dzięki zastosowa- je się tak na skutek znacznie wolniejszego niu metody amplifikacji DNA w reakcji łańcu- tempa inicjacji translacji w porównaniu do chowej termostabilnej polimerazy DNA in vi- inicjacji transkrypcji, przez co rejon tran- tro (ang. polymeraze chain reaction, PCR) skryptu nie pokryty rybosomami jest nara- (SAIKI i współaut. 1988), istnieje możliwoSć żony na działanie endorybonukleaz. Asyn- wprowadzania pożądanych miejsc restrykcyj- chronizacja transkrypcji i translacji, procesów nych do początku i końca sekwencji kodującej które u Prokaryota zachodzą niemal równo- genu. Pozwala to w następnym etapie na SciSle czeSnie, wpływa negatywnie na ogólną wydaj- okreSloną insercję genu w odpowiednio przy- noSć ekspresji genu. Potwierdzeniem tej pra- gotowany wektor. Rozróżnia się dwa zasadni- widłowoSci jest obserwacja, że mutacja chro- cze typy wektorów ekspresyjnych. Pierwszy z mosomowa w genie rne, kodującym główną nich posiada silny promotor, drugi promo- endorybonukleazę komórkową RNazę E, tor wraz z kodowanymi sygnałami do transla- znacznie obniża stopień degradacji takich cji sekwencję RBS (rejon mRNA od- transkryptów (IOST i DREYFUS 1995). Obecnie działywujący z rybosomem podczas inicjacji wektory ekspresyjne zawierają rejony MCS translacji). Dany typ wektora wykorzystywa- całkowicie zaprojektowane i zsyntetyzowane. ny jest w zależnoSci od tego, czy docelowy gen Wprowadza się tam m.in. determinanty gene- posiada silnie czy słabo rozpoznawane w ko- tyczne kodujące specyficzne układy amino- mórkach E. coli sygnały inicjacji translacji. Je- kwasów (domeny białkowe, ang. tag). Umożli- żeli klonowany gen nie posiada efektywnego wia to przeprowadzanie fuzji genu docelowe- promotora ale zawiera własny rejon RBS to go z odpowiednio wybraną domeną. Fuzje ge- włączany jest do wektora tuż za silnym promo- nowe znajdują szerokie zastosowanie głównie torem. Jest to fuzja genowa transkrypcyjna w ułatwianiu identyfikacji hybrydy przy po- (Rys. 1A). OdległoSć promotora od sekwencji mocy przeciwciał skierowanych przeciwko kodującej genu nie ma tu istotnego wpływu okreSlonej domenie. Ponadto, obecnoSć do- na wydajnoSć transkrypcji. Kiedy zdecyduje- men peptydowych wykorzystuje się do my się na wykorzystanie sygnałów translacyj- upraszczania procedur oczyszczania produk- nych obecnych w wektorze konieczna jest tów białkowych, jak np. w przypadku hybryd modyfikacja sekwencji genu w miejscu kodo- białkowych z peptydem złożonym z szeSciu nu inicjatorowego translacji (ATG). Wprowa- reszt histydynowych (His-tag) czy też z kom- dzając nowy układ nukleotydów tworzący ponentą rybonukleazy S (S-tag). Takie białka miejsca restrykcyjne NdeI (CATATG) lub NcoI hybrydowe można specyficznie wiązać na (CCATGG) obejmujące kodon inicjatorowy specjalnych złożach chromatograficznych (podkreSlony), umożliwiamy precyzyjną in- dzięki obecnoSci wyżej wspomnianych do- sercję genu w ramkę odczytu obecnego w men peptydowych. Wykorzystywanie domen wektorze rejonu RBS, złożonego z charaktery- peptydowych posiadających aktywnoSć kata- stycznych sekwencji: Shine-Dalgarno (SD) i lityczną pozwala na iloSciowy pomiar takiego kodonu ATG. W tego rodzaju fuzji genowej produktu, zarówno w testach in vitro, jak i in translacyjnej wektor dostarcza genowi doce- vivo. Proces łączenia dwóch genów wymaga lowemu zarówno promotora jak i silnej se- znacznie większej precyzji w zaplanowaniu kwencji SD (Rys. 1B). Powstaje wtedy również obu końców DNA w miejscu ich połączenia. białko niezmienione, dzikiego typu. W obu Wybór odpowiedniego miejsca restrykcyjne- wyżej wymienionych przypadkach fuzji tran- go jest podyktowany zachowaniem specyficz- skrypcja genu znajduje się pod kontrolą pro- nej dla danego genu translacyjnej ramki od- motora z wektora. Zastępowanie naturalnych czytu (Rys. 1C i 2). Fuzji translacyjnych doko- rejonów RBS efektywnymi odpowiednikami nuje się zwykle z fragmentami DNA ko- Ekspresja genów w zrekombinowanych szczepach Escherichia coli 367 Rys. 1. Fuzje genowe. (A) transkrypcyjna; (B) translacyjna; (C) translacyjna złożona, dająca białko hy- brydowe. NdeI, EcoRI oznaczają nazwy enzymów restrykcyjnych użytych to trawienia DNA. Met itd. oznaczają skróty nazw poszczególnych aminokwasów. dującymi domeny peptydowe znajdującymi presji genu. Natomiast poprzez wybór właSci- się w tej samej ramce odczytu co kodon ATG wego gospodarza bakteryjnego możemy wektora (fuzje proksymalne). Powstaje wtedy wpływać na kontrolę poszczególnych etapów białko hybrydowe, z dodatkowymi aminokwa- procesu ekspresji genu. Przykładami takich sami w częSci N-terminalnej. Przeprowadzane bakterii są rekombinanty zawierające w chro- są także fuzje z dystalną częScią docelowego mosomie dodatkowe kopie genów ko- genu, wymagające takiego zaplanowania ko- dujących białka kontrolujące proces tran- ńca genu, aby zachować właSciwą ramkę od- skrypcji (np. represory) oraz zastosowanie de- czytu dla fragmentu DNA kodującego C-ko- fektywnych mutantów do wydłużania stabil- ńcowy peptyd (fuzja dystalna). Prezentowane noSci transkryptów mRNA (rne), lub przykłady pokazują, że dzięki technikom inży- wydłużania stabilnoSci powstających produk- nierii genu możliwa jest taka korekta jego bu- tów białkowych (ompTi lon, kodujących pro- dowy, która zapewnia większą wydajnoSć eks- teazy OmpT i La). SYSTEM NADPRODUKCJI BIAŁEK BAKTERIOFAGA T7 Jednoznaczna odpowiedx na pytanie, który nych zapewnia najwyższy poziom nadproduk- z obecnie dostępnych systemów ekspresyj- cji białka w każdym indywidualnym przypadku 368 MARIAN SĘKTAS Rys. 2. Przykłady fuzji genowych translacyjnych prawidłowej (A) i nieprawidłowych z przesunięciem ramki odczytu (B i C). Zaznaczono położenie promotora, sekwencji SD i kodonu inicjatorowego. Pozycje nukleotydów tworzących na- turalnie uszeregowane kodony ponumerowano odpowiednio 1, 2 i 3. nie jest możliwa. Wybór odpowiedniego syste- przykład mogą służyć promotor laktozowy Plac mu będzie zależał od wielu czynników, a w i jego pochodne PlacUV5L8, Ptac, oraz promotor szczególnoSci od stopnia tolerancji komórek arabinozowy PBAD. Analizując właSciwoSci do- gospodarza na obecnoSć obcego białka oraz z stępnych systemów ekspresyjnych pod kątem zasady, że siła promotora determinuje możliwy stopnia regulacji ekspresji, osiąganego pozio- do osiągnięcia stan jego represji (LANZER i mu nadprodukcji białka, powszechnoSci uży- BUJARD 1988). W zależnoSci od tego wybierze- cia, a także różnorodnoSci dodatkowych zasto- my system, w którym słabszy promotor jest sowań, nasz wybór padnie na system wy- SciSlej kontrolowany albo silny promotor jest wodzący się z genomu bakteriofaga T7, skon- gorzej regulowany. Tego dokonuje się już na struowany w połowie lat 80., niezależnie w etapie wyboru odpowiedniego wektora, cha- dwóch laboratoriach amerykańskich (TABOR i rakteryzującego się okreSloną liczbą kopii na RICHARDSON 1985, STUDIER i MOFFAT 1986). komórkę bakteryjną. Przykładowo wektor, któ- System jest złożony w swojej podstawowej for- rego struktura oparta jest na rejonie replikacyj- mie z genu, kodującego polimerazę RNA faga nym plazmidu koniugacyjnego F osiąga po- T7, oraz z promotora T7 (ł10), wywodzącego ziom 1 2 kopii plazmidu na komórkę bakte- się również z genomu tego bakteriofaga. Sys- ryjną; pochodne plazmidu pSC101 replikują tem T7 posiada wiele unikatowych właSciwo- się na poziomie 5 8 kopii na komórkę; po- Sci. Specyficzny promotor rozpoznawany jest chodne replikonu P15A utrzymują stan 15 20 przez polimerazę RNA faga T7 a nierozpozna- kopii na komórkę; pochodne plazmidu wany przez polimerazę komórkową gospoda- pBR322 30 40 kopii a pochodne plazmidu rza. Polimeraza faga ma zdolnoSć do 8-krotnie pUC replikują się na poziomie ponad 600 kopii szybszego wydłużania transkryptów w porów- na komórkę (HELINSKI i współaut. 1996). Naj- naniu z polimerazą gospodarza (IOST i częSciej wykorzystywanymi promotorami w współaut. 1992). Polimeraza RNA T7 jest nie- konstruktach wektorowych są promotory bak- wrażliwa na antybiotyk rifampicynę co jest wy- teriofagowe (PL i PR z faga oraz 10 z faga T7 korzystywane do blokowania ekspresji genów oba swoiste dla E. coli; MAKRIDES 1996) jak i gospodarza, w celu specyficznego wyznakowa- pochodzące od wirusów eukariotycznych, w nia i identyfikacji białek kodowanych przez przypadku wektorów do pracy w komórkach geny, których ekspresja zależna jest od promo- eukariotycznych (np. PCMV z wirusa cytomega- tora T7. Polimeraza fagowa jest wrażliwa zasad- li w plazmidowej pochodnej wirusa SV40). niczo tylko na swoiste terminatory transkryp- Niektóre promotory pochodzące z chromoso- cji i usytuowanie takiego terminatora w wekto- mu E. coli są również wykorzystywane. Za rze przyczynia się do podniesienia wydajnoSci Ekspresja genów w zrekombinowanych szczepach Escherichia coli 369 procesu transkrypcji. Specyficzna terminacja tego genu (TABOR i RICHARDSON 1985). Zdecy- przySpiesza cyrkulację enzymu czyli gotowoSć dowanie najlepszą metodą jest zastosowanie pojedynczej molekuły enzymu do kolejnych zrekombinowanego szczepu E. coli z genem rund inicjacji transkrypcji genu docelowego. polimerazy zlokalizowanym na defektywnym W zależnoSci od stopnia złożonoSci wektora re- profagu , trwale zintegrowanym z chromoso- jon transkrypcji może zawierać albo tylko se- mem gospodarza w miejscu attB. Gen ten znaj- kwencję promotora T7, która stanowi konser- duje się pod kontrolą represora LacI i promoto- watywny układ 23 nukleotydów, albo dodatko- ra PlacUV5L8 (STUDIER i MOFFATT 1986). W tym wo rejon RBS, pochodzący z genu białka otocz- przypadku indukcja ekspresji polega na poda- ki 10. RBS obejmuje 6-cio nukleotydową se- niu induktora IPTG (izopropylo- -D-tiogalakt- kwencję SD, sekwencję epsilon oraz kodon ini- ozyd) w celu inaktywacji represora laktozowe- cjatorowy ATG (OLINS i współaut. 1988, OLINS go, co prowadzi zarówno do aktywacji promo- i RANGWALA 1989, ROSENBERG i współaut. tora laktozowego PlacUV5 (ekspresja polimera- 1987; STUDIER i współaut. 1990). W niektórych zy RNA T7), jak i odblokowania pełnych możli- konstruktach w rejonie promotorowym T7 woSci transkrypcyjnych rejonu promotorowe- wprowadzono ponadto sekwencję operatora go T7 z operatorem lacO. Rezultatem indukcji lacO wiążącą represor laktozowy LacI systemu zawierającego gen polimerazy RNA (DUBENDORFF i STUDIER 1991). Operator zloka- T7 oraz gen docelowy zależny od promotora lizowany jest na plazmidach ekspresyjnych tuż 10 jest uzyskanie nadprodukcji białka stano- za promotorem, a przed sekwencją epsilon. wiące kilka- do kilkudziesięciu procent wszyst- ObecnoSć represora LacI zabezpiecza przed kich białek komórkowych. Ostatnio system T7 przypadkową transkrypcją powodowaną ak- został uzupełniony o plazmid zawierający geny tywnoScią innych promotorów zlokalizowa- kodujące tRNA rozpoznające rzadko wystę- nych na plazmidzie jak i obecnoScią polimera- pujące kodony na mRNA, niecharakterystycz- zy RNA T7 w niskim stężeniu w komórce. Ist- ne dla E. coli (NOVY i współaut. 2001). Umożli- nieją trzy zasadnicze sposoby dostarczania wia to produkcję białek kodowanych przez genu polimerazy RNA faga T7 do systemu eks- geny pochodzące od niespokrewnionych z tą presyjnego i indukcji jego ekspresji. Jednym ze bakterią organizmów. Podobnie modyfika- sposobów jest metoda infekcji bakterii cjom i udoskonaleniom stale ulega szczep go- niosących wektor z klonowanym genem zmo- spodarza E. coli niosący gen polimerazy RNA dyfikowanym wirusem , M13 lubT7 (STUDIER T7. Uzyskanie mutanta z delecją operonu lakto- i MOFFATT 1986). ródłem genu może być Sred- zowego (m. in. brak permeazy laktozowej) niokopiowy plazmid, w którym gen kodujący umożliwia liniową i bezpoSrednią zależnoSć polimerazę znajduje się pod kontrolą tempera- pomiędzy stężeniem stosowanego induktora turowrażliwego represora faga -CI857. Daje IPTG a jego efektywnym poziomem we wnę- to możliwoSć termicznej indukcji trankrypcji trzu komórki bakteryjnej. RCISŁA KONTROLA TRANSKRYPCJI GENU Poważnym problemem w procesie nadpro- tywnych , w których DNA plazmidu ekspresyj- dukcji białek jest brak Scisłej kontroli ekspresji nego uległo niekorzystnym przekształceniom. genu polimerazy RNA T7 ( przeciekanie tran- Łagodnym skutkiem tego zjawiska jest produk- skrypcji , ang. leakage), co powoduje niekon- cja białka na bardzo niskim poziomie lub jej trolowaną ekspresję genu docelowego. Stały, ni- całkowity brak (DOHERTY i współaut. 1993). Ist- ski poziom ekspresji genu polimerazy prowadzi nieje szereg narzędzi molekularnych do uSciSla- w niektórych przypadkach do niestabilnego nia kontroli ekspresji genu polimerazy RNA T7. utrzymywania się plazmidu ekspresyjnego w Naturalnym inhibitorem aktywnoSci polimera- komórkach (STUDIER i współaut. 1990, zy RNA jest lizozym T7. Wprowadzenie genu MERTENS i współaut. 1995, GROSSMAN i tego białka na dodatkowym plazmidzie i zapew- współaut. 1998) lub do ich Smierci (DONG i nienie jego konstytutywnej transkrypcji sku- współaut. 1995). Dotyczy to szczególnie genów tecznie eliminuje aktywnoSć polimerazy w wa- kodujących białka o silnej aktywnoSci biologicz- runkach represji (STUDIER 1991, DUBENDORFF i nej. Taki stan permanentnej ekspresji może pro- STUDIER 1991). Powoduje to niestety także efek- wadzić również do selekcji klonów nieproduk- ty uboczne w postaci obniżenia całkowitej wy- 370 MARIAN SĘKTAS dajnoSci produkcji białka oraz przedwczesną autolizę zaindukowanych bakterii. Innym spo- sobem na obniżenie poziomu polimerazy RNA faga T7 w fazie represji jest zastosowanie 0.2% 1% dodatku glukozy do pożywki, co wywołuje globalny efekt obniżenia poziomu cAMP i dezaktywację wielu promotorów zale- żnych od białka aktywatora CAP (GROSSMAN i współaut. 1998). Wykazano, że pomimo obec- noSci mutacji L8, która znacznie obniża stopień wiązania się białka CAP w rejonie promotoro- wym PlacUV5, indukcja transkrypcji z tego pro- motora jest nadal zależna od stymulacji CAP/cAMP (PAN i MALCOLM 2000). W tej sytu- acji obecnoSć glukozy zapobiega takiej aktywa- cji. W związku z problemem toksycznoSci pro- duktów genów rozpoczęto poszukiwania mo- Rys. 3. Struktura genetyczna wektora ekspresyj- żliwoSci kontrolowania liczby kopii genu doce- nego pET-BAC2, z niezależnie kontrolowanymi funkcjami ekspresji genów (promotor PT7) i am- lowego poprzez regulację liczby kopii wektora plifikacji DNA (promotor PBAD). ekspresyjnego, od minimalnej liczby kopii w warunkach represyjnych do dużej w miarę po- Nazwy genów i elementów regulatorowych ozna- trzeb, np. w czasie ekspresji genu lub na eta- czają: araC gen represora/aktywatora AraC; cat gen opornoSci na chloramfenikol; lacI gen represo- pach klonowania lub sekwencjonowania genu. ra laktozowaego LacI; parA i parB geny białek odpo- Wydaje się, że skonstruowany ostatnio wektor wiedzialnych za partycję plazmidu; repE gen białka ekspresyjny z modulowaną kontrolą replikacji RepE inicjującego replikację z oriS; trfA gen białka plazmidu od 1 kopii do ponad 40 kopii, daje naj- TrfA inicjującego replikację z oriV; TT7 terminator niższy poziom niekontrolowanej ekspresji genu transkrypcji T7. Ponadto zaznaczono unikalne miej- w warunkach represji systemu T7 (SEKTAS i sca restrykcyjne HindIII i NotI w miejscu wprowadza- nia genu docelowego. SZYBALSKI 2002). Struktura tego wektora jest oparta na plazmidzie pBeloBAC11 (KIM i współaut. 1996). Wektor nazwany pET-BAC2 poziomu uzyskiwanego przez zastosowanie ty- (Rys. 3) posiada dwa niezależne replikony: kon- powego wektora opartego na replikonie stytutywny pochodzący z plazmidu F, złożony pBR322 (Tabela 1, wiersz4i 12). Ponadto, przy z origin replikacji oriS/RepE wraz z systemem optymalnym stężeniu induktora IPTG osiągano partycji parABC, oraz warunkowy złożony z poziom aktywnoSci -galaktozydazy porówny- origin replikacji oriV wywodzący się z plazmidu walny do wektora pBR322 (Tabela 1, wiersz 10 i RK2 wraz z genem kodującym swoiste białko 13). Nadprodukcja białka z pojedynczej kopii inicjujące replikację TrfA, kontrolowanym genu jest możliwa w tym plazmidzie za sprawą przez promotor arabinozowy PBAD (WILD i dodatkowego modułu replikacyjnego oriV/ współaut. 2001). Dzięki pierwszej funkcji pla- TrfA, który umożliwia podniesienie iloSci kopii zmid jest stabilnie utrzymywany w komórce wektora w czasie transkrypcji z promotora T7. przy stałej iloSć kopii 1 2. Hodowla komórek Okazuje się, że terminator T7 nie działa ze 100% niosących taki plazmid w pożywce z dodatkiem wydajnoScią i polimeraza RNA T7 przechodząc glukozy (0,2%), daje nadzwyczaj wysoki poziom znak stopu transkrybuje dodatkowo gen trfA, represji promotora T7, i nieomal całkowite wy- który jest położony w zgodnej orientacji. Białko eliminowanie niekontrolowanej transkrypcji. TrfA inicjuje replikację plazmidu z dodatkowe- Wyniki pomiaru ekspresji genu reporterowego go origin oriV i to właSnie pozwala na podnie- lacZ w zależnoSci od liczby kopii wektora, w sta- sienie liczby kopii wektora (a tym samym dawki nie przed jak i po indukcji, ilustruje Tabela 1. Po- genu) do 5 10. Jakby potwierdzeniem tego jest ziom kontroli genu reporterowego badano po- 2 3 krotnie niższy poziom produkcji białka - przez iloSciowy pomiar aktywnoSci jego pro- galaktozydazy uzyskany z pochodnej plazmidu F duktu, enzymu -galaktozydazy (MILLER 1992). nie posiadającej dodatkowego origin replikacji W przypadku plazmidu pET-BAC2 uzyskano (pBeloBAClacZ Tabela 1, wiersz 3). Dodatko- wielokrotnie niższy poziom niekontrolowanej wym atutem łagodnego zwiększania się liczby transkrypcji w fazie represji w porównaniu do Ekspresja genów w zrekombinowanych szczepach Escherichia coli 371 Tabela 1. Poziom ekspresji genu reporterowego lacZ w bakteriach E.coli Tuner (DE3) w zależnoSci od liczby kopii wektora ekspresyjnego, po 3 godzinach indukcji induktorem IPTG. a b c Rodzaj replikonu IPTG (mM) Jednostki Millera Liczba kopii plazmidu (1) (-) 0,0 1,8 0 (2) F 0,0 21 1 2 (3) F 1,0 17,240 1 2 (4) F/RK2 0,0 18 1 2 (5) F/RK2 0,0 (+0,2% D-glukoza) 9 1 2 (6) F/RK2 0,0 (+0,01% L-arabinoza) 118 20 30 (7) F/RK2 0,05 11,525 3 4 (8) F/RK2 0,1 18,730 4 5 (9) F/RK2 0,2 37,635 4 5 (10) F/RK2 0,5 48,020 3 4 (11) F/RK2 1,0 44,870 2 3 d (12) pBR322 0,0 122 800 30 40 (13) pBR322 1,0 48,370 30 40 a Bakterie E.coli Tuner(DE3) (BL21(DE3) lac; SEKTAS i SZYBALSKI 2002) bez plazmidu (wiersz 1) lub niosące następujące plazmidy: pBe- lo-BAClacZ (wiersze 2 3), pET-BAC2lacZ (wiersze 4 11) lub pET24lacZ (linie 12-13) hodowanow5ml pożywkach LB w obecnoSci 12,5 g chloramfenikolu na ml. Hodowle zainokulowano 1:200 używając nocnej kultury odpowiednich bakterii. Po 1,5 h hodowli w 37C, zainduko- wano ekspresję genu lacZ dodając induktora IPTG (od 0,05 do 1,0 mM). Hodowle prowadzono następnie przez 3 godziny. Równolegle hodo- wano szczepy kontrolne nie poddane indukcji IPTG w pożywce LB (wiersze 1, 2, 4i 11), lubzdodatkiem D-glukozy (do 0,2% końcowego stęże- b nia; wiersz 4) lub L-arabinozy (do 0,01% końcowego stężenia; wiersz 5). Pomiar aktywnoSci -galaktozydazy był wykonywany metodą opi- saną przez MILLER (1992) wykorzystującą sztuczny substrat ONPG (orto-nitrofenylo- -galaktopiranozyd). W teScie in vitro mierzono spektro- c fotometrycznie stopień enzymatycznego rozkładu ONPG. Do testu pobierano 50 l hodowli bakteryjnej. Liczba kopii plazmidów była okre- Slana na podstawie densytometrycznego pomiaru liniowej formy plazmidów, po wyizolowaniu z bakterii i rozdziale w żelu agarozowym. d Pierwsza wartoSć dotyczy serii plazmidów pET- z genem opornoSci na kanamycynę (np. pET24), druga wartoSć dotyczy serii plazmidów z ge- nem opornoSci na ampicylinę (np. pET21). kopii genu w fazie ekspresji jest brak efektu za- zmidowego DNA uruchamiana dla potrzeb klo- hamowania wzrostu hodowli bakteryjnej często nowania lub sekwencjonowania DNA. Po doda- obserwowanej w przypadku hodowli z wekto- niu induktora arabinozy (0,01%) w ciągu 3 4 rem o wysokiej stałej liczbie kopii. W przypadku godzin uzyskujemy efekt 30 40 krotnej amplifi- plazmidu pET-BAC2 możliwa jest także, niezale- kacji DNA, przy zachowaniu stanu represji pro- żna od procesu ekspresji genu, amplifikacja pla- motora T7 (Tabela 1, wiersz 6; Rys. 4, Scieżka 4). Rys. 4. Porównanie liczby kopii plazmidu pE- T-24lacZ (pochodna pBR322) oraz pET-BAC2lacZ (pochodna F/RK2) w zależnoSci od rodzaju stoso- wanego induktora. Plazmidy izolowanoz 3ml bakterii E. coli Tuner(DE3) po 2 godzinnej indukcji oraz nanoszono na 0,65% żel agarozowy z takiej samej iloSci bakterii, po uprzednim trawieniu enzymem BamHI. Kolejne Scieżki zawierają następujący DNA plazmidowy: 1 pE24lacZ z bakterii nieindukowanych; 2 pET24lacZ z bakterii indukowa- nych 2mM IPTG; 3 pET-BAC2lacZ z bakterii nieindu- kowanych; 4 pET-BAC2lacZ z bakterii indukowanych 0,01% L-arabinozą; 5 pET-BAC2lacZ z bakterii induko- wanych 0,01% L-arabinozą oraz 2mM IPTG; 6 pET-BAClacZ z bakterii indukowanych 2mM IPTG; W wzorce masowe, DNA faga l trawiony HindIII. Wielko- Sci prążków w parach zasad od góry żelu: 23.130, 9416, 6557 i 4361. 372 MARIAN SĘKTAS PODSUMOWANIE Ekspresja rekombinowanych białek w bak- nych a także tworzeniem użytecznych rekom- teriach, a w szczególnoSci w szczepach E. coli binantów bakteryjnych nie zostały do końca jest wydajnym sposobem na otrzymywanie wyczerpane. Kierunek poszukiwań w tej dzie- ogromnych iloSci tych białek, które w naturze dzinie był i pozostanie taki sam zwiększenie są produkowane w iloSciach Sladowych. Wyda- efektywnoSci produkcji i uproszczenie proce- je się, że możliwoSci techniczne i twórcze w dur oczyszczania białek, znajdowane rozwiąza- tym dziale inżynierii genetycznej, który zajmu- nia zaskakująco różne. je się konstruowaniem wektorów ekspresyj- EXPRESSION OF GENES CLONED IN PLASMID VECTORS IN RECOMBINANT ESCHERICHIA COLI STRAINS S u mma r y Use of Escherichia coli bacteria as a host for expressing a wide variety of DNAs from prokaryotic high-level expression of cloned genes has become and eukaryotic sources. In principle, the T7 system common. The purification of a recombinant protein can be completely selective because host RNA poly- is greatly accelerated if the protein can be isolated merase and phage s polymerase recognize different from cells that overproduce it. To maximize expres- promoters. However, synthesis of recombinant pro- sion, the cloned gene must be transcribed and trans- teins, especially those that are toxic to the host, must lated as efficiently as possible. This is possible due to be controlled, being at zero or non-toxic levels in the construction of expression vectors, modified uninduced cells, and high only after induction of ex- plasmids with useful features, which can be propa- pression during the appropriate phase of growth. gated and controlled in special hosts (expression sys- Basal activity of the T7 RNA polymerase in uninduced tems). Usually, vectors for cloning and expressing tar- cells is lower when the growth medium contains glu- get DNA are derived from medium-copy plasmids like cose (catobolite repression) and/or its natural inhibi- pBR322. E. coli expression systems should meet sev- tor T7 lysozyme. Another way to reduce the basal ex- eral criteria including (i) minimal basal expression of pression of the target genes is to use expression vec- the gene to be expressed under repressed conditions, tors with lower or controllable copy numbers. The (ii) fast and uncomplicated induction of a wide vari- last possibility is offered by a new single-condi- ety of genes to a high level of expression, and, (iii) tional-medium copy vector, a derivative of two easy cloning and DNA manipulation features. This ar- replicons with different functions, oriS/RepE from ticle describes how the most common T7 expression plasmid F and oriV/TrfA from RK2 plasmid. The ge- system, derived from bacteriophage T7, functions. netic elements from F plasmid enable stable mainte- The system consists of a plasmid vector that allows nance of a single copy of the plasmid, while the RK2 cloning of the target DNA under T7 promoter con- replicon permits dosage-dependent gene expression trol, and the T7 RNA polymerase gene borne by the and serves as the means for plasmid DNA amplifica- recombinant bacterial host. The system is capable of tion. LITERATURA DOHERTY J. P., LINDEMAN R., TRENT R. J., GRAHAM M. W., HELINSKI D. R., TOUKDARIAN A., NOVICK R. P., 1996. Repli- GRAHAM D. M., 1993. Escherichia coli host strains cation control and other stable maintenance me- SURE and SRB fail to preserve a palindrome clo- chanisms of plasmids. [W:] Escherichia coli and ned in lambda phage; improved alternate host Salmonella: cellular and molecular biology. strains. Gene 124, 29 34. NEIDHARDT F. C., CURTISS III R., INGRAHAM J., LIN DONG H., NILSON L., KURLAND C. G., 1995. Gratuitous E. C. C., LOW K. B., MAGASANIK B., REZNIKOFF W. S., overexpession of genes in Escherichia coli leads to RILEY M., SCHAECHTER M., UMBARGER H. (red.). Was- growth inhibition and ribosome destruction. J. hington DC, American Society for Microbiology, Bacteriol. 177, 1497 1504. 2295 2324. DUBENDORFF J. W., STUDIER F. W., 1991. Controlling ba- IOST I., DREYFUS M., 1995. The stability of Escherichia sal expression in an inducible T7 expression sys- coli lacZ mRNA depends upon the simultaneity of tem by blocking the target T7 promoter with lac re- its synthesis and translation. EMBO J. 195, pressor. J. Mol. Biol. 219, 45 59. 3252 3261. GROSSMAN T. H., KAWASAKI E. S., PUNREDDY S. R., OSBURNE IOST I., GUILLEREZ J., DREYFUS M., 1992. Bacteriophage M. S., 1998. Spontaneous cAMP-dependent dere- T7 RNA polymerase travels far ahead of riboso- pression of gene expression in stationary phase mes in vivo. J. Bacteriol. 174, 619 622. plays a role in recombinant expression instabili- KIM U.-J., BIRREN B. W., SLEPAK T., MANCINO V., BOYSEN C., ty. Gene 209, 95 103. KANG H.-L., SIMON M. I., SHIZUYA H., 1996. Construc- Ekspresja genów w zrekombinowanych szczepach Escherichia coli 373 tion and characterization of a human bacterial PROTEIN EXPESSION AND PURIFICATION, 2000, 20, str 533. artificial chromosome library. Genomics 34, ROSENBERG A. H., LADE B. N., CHUI D. -s., LIN S. -W., DUNN 213 218. J. J., STUDIER F. W., 1987. Vectors for selective LANZER M., BUJARD H., 1988. Promoters largely determi- expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. ne the effeciency of repressor action. Proc. Natl. Gene 56, 125 135. Acad. Sci. USA 85, 8973 8977. SAIKI R.K., GELFAND D. H., STOFFEL S., SCHARF S. J., MAKRIDES S. C., 1996. Strategies for achieving high HIGUCHI R., HORN G. T., MULLIS K. B., ERLICH H. A., level expression of genes in Escherichia coli. 1988. Primer-directed enzymatic amplification of Microbiol. Rev. 60, 512 538. DNA with a thermostable DNA polymerase. Scien- MERTENS N., REMAUT E., FIERS W., 1995. Tight transcrip- ce 239, 487 491. tional control mechanism ensures stable hi- SEKTAS M., SZYBALSKI W., 2002. Novel single-copy pETco- gh-level expression from T7 promoter-based co vector with dual controls for amplification and expression plasmids. Biotechnology 13, 175 179. expression. InNovations 14, 6 8 MILLER J. H., 1992. A short course in bacterial genetics: STUDIER F. W., 1991. Use of bacteriophage T7 lysozyme A laboratory manual and handbook for Escheri- to improve an inducible T7 expression system. J. chia coli and related bacteria. Cold Spring Harbor Mol. Biol. 219, 37 44. Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1992. STUDIER F. W., MOFFATT B. A., 1986. Use of bacteriopha- NOVY R., DROTT D., YAEGER K., MIERENDORF R., 2001. ge T7 RNA polymerase to direct selective high-level Overcoming the codon bias of E. coli for enhanced expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189, protein expression. InNovations 12, 1 3. 113 130. OLINS P. O., DEVINE C. S., RANGWALA S. H., KAVKA K. S., STUDIER F.W., ROSENBERG A. H., DUNN J .J., DUBENDORFF J. 1988. The T7 phage gene 10 leader RNA, a riboso- W., 1990. Use of T7 RNA polymerase to direct me-binding site that dramatically enhances the expression of cloned genes. Methods Enzymol. expression of foreign genes in Escherichia coli. 185, 60 89. Gene 73, 227 235 TABOR S., RICHARDSON C. C., 1985. A bacteriophage T7 OLINS P. O., RANGWALA S.H., 1989. A novel sequence ele- RNA polymerase/promoter system for the control- ment derived from bacteriophage T7 mRNA acts led exclusive expression of specific genes. Proc. as an enhancer of translation of the lacZ gene in Natl. Acad. Sci. USA 262, 1074 1078. Escherichia coli. J. Biol. Chem. 264, 16973 16976 WILD J., HRADECNA Z., SZYBALSKI W. 2001. Single-co- PAN S., MALCOLM B. A., 2000. Reduced background py/high-copy (SC/HC) pBac/oriV novel vectors for expression and improved plasmid stability with genomics and gene expression. Plasmid 45, pET vectors in BL21 (DE3). BioTechniques 29, 142 143. 1234 1238.