Zobaczyć sygnał  metody obrazowania zmian
stężenia jonów wapnia w komórce
STRESZCZENIE
PaweÅ‚ Pomorski1,2,*ð
ony wapnia są jednymi z najpopularniejszych wtórnych przekaz
ników sygnału w świe-
Jcie ożywionym. Opracowane w ostatnich trzydziestu latach metody wizualizacji stężenia
jonów wapnia w roztworze pozwalają ten sygnał obserwować w żywych komórkach, tkan- 1
Åšrodowiskowe Multimodalne Laboratorium
kach czy też całych organizmach. Poniższy artykuł przedstawia dostępne dziś narzędzia do
Adhezji i Ruchu Komórek, Konsorcjum Nano-
obrazowania sygnału wapniowego in vivo, zarówno związki chemiczne używane jako sondy
BioGeo, projekt NanoFun, Instytut Biologii Do-
wapniowe jak też ich metody wizualizacji i kalibracji wyników.
świadczalnej im. M. Nenckiego PAN, Warszawa
2
Pracownia Molekularnych Podstaw Ruchu
WPrOWadZenie
Komórek, Zakład Biochemii, Instytut Biologii
Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN, War-
Koordynacja i synchronizacja licznych procesów chemicznych, składających
szawa
się na funkcjonowanie organizmów wymusiła powstanie wyspecjalizowanych
*ð
mechanizmów przekazywania sygnałów pomiędzy otoczeniem komórki a jej
Instytut Biologii Doświadczalnej im. M.
Nenckiego PAN, ul. Pasteura 3, 02-093
wnętrzem, jak również pomiędzy przedziałami komórkowymi. Sygnały te są
Warszawa, e-mail: [e-mail]
siłą rzeczy przejściowe i ich badanie wymaga innych metod niż te, używane
do poznawania struktury, czy też metabolizmu komórki. Jednym z najbardziej
Artykuł otrzymano 2 paz
dziernika 2012 r.
uniwersalnych i powszechnych typów sygnalizacji komórkowej jest uwalnia-
Artykuł zaakceptowano 22 paz
dziernika
nie jonów wapnia do cytoplazmy [1]. Mimo, że analityczne oznaczanie stężenia
2012 r.
jonów nieorganicznych wydaje się z punktu widzenia chemii zadaniem raczej
nietrudnym, to okazuje się, że metody te kompletnie zawodzą przy próbach ob- Słowa kluczowe: wapń, przekazywanie sy-
gnałów, obrazowanie, mikroskopia
serwacji sygnału wapniowego w komórkach. Dzieje się tak z kilku przyczyn. Po
pierwsze, sygnał wapniowy jest wzrostem stężenia wolnych jonów wapnia w
Wykaz skrótów: BRET (ang. Bioluminescence
cytoplazmie a nie wzrostem całkowitej ilości wapnia w komórce. Każda żywa
Resonance Energy Transfer)  transfer ener-
komórka zawiera znaczną ilość wapnia związaną w kompleksie z buforem biał-
gii wzbudzenia bioluminescencyjnego; CFP
kowym [2] i zamkniętą w tak zwanych wewnątrzkomórkowych magazynach
(ang. Cyan Fluorescence Protein)  błękitne
wapnia [3] (głównie siateczce śródplazmatycznej). Pomiar stężenia jonów wap-
białko fluorescencyjne; FRET (ang. Fluorescence
nia w lizatach komórkowych nie jest zatem narzÄ™dziem odpowiednim do bada- Resonance Energy Transfer, Förster Resonance
Energy Transfer)  transfer energii przez re-
nia sygnału wapniowego. Badaczom tego sygnału pozostają zatem metody po-
zonans Förstera, tutaj rozwijany jako transfer
zwalające na bezpośredni pomiar jonów wapnia w roztworze: elektrofizjologicz-
energii wzbudzenia fluorescencyjnego dla
ne i fluorescencyjne. W bieżącym artykule autor zamierza pokrótce przedstawić
odróżnienia od BRET; GFP (ang. Green Fluores-
metody pomiaru stężenia jonów wapniowych przy pomocy fluorescencyjnych
cence Protein)  zielone białko fluorescencyjne;
sond molekularnych. Nacisk zostanie przy tym położony na metody pomiaru
YC (ang. Yellow Cameleon)  Cameleon o żółtej
emisji światła; YFP  żółte białko fluorescen-
pozwalające na obrazowanie rozkładu sygnału wewnątrz komórki, choć metody
cyjne (ang. Yellow Fluorescence Protein)
fluorescencyjne mogą być również używane do pomiarów fluorymetrycznych.
Podziękowania: Artykuł współfinansowany
Mówiąc o obrazowaniu sygnału wapniowego trzeba jednak zdawać sobie
ze środków Europejskiego Funduszu Rozwo-
sprawÄ™ z jednego, podstawowego ograniczenia: wszelkie metody obrazowania
ju Regionalnego w ramach Programu Opera-
są relatywnie wolne w porównaniu z metodami elektrofizjologicznymi. W przy- cyjnego Innowacyjna Gospodarka NanoFun
POIG.02.02.00-00-025/09. Autor wyraża rów-
padku pomiarów kalibrowanych, wymagających rejestracji więcej niż jednego
nież serdeczne podziękowania dr Dorocie Wy-
obrazu by określić rozkład stężenia wapnia, częstotliwość obrazowania rzędu
pych za czas poświęcony na lekturę rękopisu
dwudziestu map tego rozkładu na sekundę można uznać za wysoką. Metody te
i liczne uwagi, które czynią tekst bardziej zro-
doskonale nadają się do badania sygnałów wapniowych pochodzących od po-
zumiałym.
budzenia receptorów metabotropowych, których czas trwania mierzony jest w
sekundach lub minutach, i do takich pomiarów są najczęściej używane [4]. Trud-
niej natomiast obrazować zmiany stężenia jonów wapnia związane z potencjała-
mi czynnościowymi, których czas trwania mierzony jest w milisekundach. Nie
znaczy to wcale, że takie pomiary są niemożliwe. Smetters i inni pokazali, że
choć wzrost stężenia jonów wapnia obserwowany po pobudzeniu neuronu na-
stępuje bardzo szybko, to sam sygnał wapniowy trwa dłużej niż związany z nim
potencjał co pozwala na obrazowanie odpowiedzi pojedynczych neuronów [5].
Metody obrazowania są użyteczne zwłaszcza tam, gdzie występują ciągi
pobudzeniowe (w postaci szeregu szybko następujących po sobie potencjałów
czynnościowych), prowadzące do całkowania sygnału wapniowego w cytopla-
zmie przez dodawanie do siebie skutków kolejnych pobudzeń [6], a różniczko-
wanie krzywych stężenia jonów wapnia pozwala precyzyjnie określić momenty
Postępy Biochemii 58 (4) 2012 465
występowania poszczególnych potencjałów w ciągu [5].
Wydłużenie sygnału wapniowego w stosunku do depolary-
zacji błony pozwala też wizualizować metodą obrazowania
wapniowych sond molekularnych pobudzenia wapniowe
mięśni [7].
WcZeSne OPtycZne metOdy badania Stężenia
EGTA
jOnóW WaPnia: Od akWOryny dO Quin-2
Historia obrazowania stężenia jonów wapnia w komór-
kach wiąże się z powstaniem samej koncepcji sondy mole-
kularnej: wprowadzanej do układu cząsteczki pozwalają-
cej na nieinwazyjny pomiar parametru środowiska przez
obserwację zmian jej właściwości fizycznych (takich jak
Quin 2
fluorescencyjne czy chemiluminescencyjne, ale nie tylko).
PierwszÄ… sondÄ™ molekularnÄ…, pozwalajÄ…ca na optyczne mo-
nitorowanie zmian poziomu jonów wapnia stworzyła sama
natura. Na początku lat sześćdziesiątych ubiegłego wieku,
w cieśninie Juan de Fuca w stanie Waszyngton odkryto w
meduzach rodzaju Aequorea białko bioluminescencyjne 
akworynę [8]. Akworyna składa się z dwóch związków che-
micznych: białka apoakworyny i kofaktora zwanego kolen-
trazyną, który jest niezbędny by białko było zdolne do bio-
luminescencji. W sekwencji aminokwasowej apoakworyny
Fura-2
znajduje się domena EF-hand, charakterystyczna dla białek
wiążących wapń. Po związaniu jonu wapnia akworyna utle-
rycina 1. Struktura chemicznych sond wapniowych i ich pokrewieństwo z che-
nia kolenterazynę, czemu towarzyszy emisja fotonu błękit- latorem wapnia  EGTA. Od góry wzory strukturalne EGTA, Quin 2 i Fura-2.
Widać wspólne cechy, w tym cztery naładowane grupy karboksylanowe i dwa
nego światła (469 nm) [9]. Cechy te szybko wykorzystano w
atomy azotu odpowiedzialne za kompleksowanie jonu wapnia. W sondach wap-
pomiarach sygnału wapniowego. Kolenterazyna co prawda
niowych dodano także pierścienie, w celu uzyskania właściwości fluorescencyj-
ulega zużyciu podczas utleniania koniecznego do emisji fo- nych związku.
tonu, ale jako że jest związkiem rozpuszczalnym w lipidach,
przenika przez błonę komórkową i łatwo ją uzupełniać pod-
kacji czterech grup COOH barwnika grupÄ… acetylometylo-
czas trwania pomiaru. Akworyna okazała się doskonałym
wą. Związek stawał się wówczas słabo hydrofobowy, choć
narzędziem do pomiarów stężenia jonów wapnia, aczkol-
rozpuszczony w DMSO lub metanolu mieszał się z wodą,
wiek zdecydowanie gorzej nadaje siÄ™ do obrazowania roz-
pozostając nadal zdolnym do przenikania do komórki. W
kładu sygnału wapniowego w komórkach. Przyczyną tego
cytoplazmie znajdują się niespecyficzne esterazy, które hy-
jest słaba wydajność emisji fotonów (jeden foton na tysiąc
drolizują wiązanie estrowe. W konsekwencji, sonda znów
utlenionych cząsteczek kolenterazyny). Bezwzględną zaletą
staje się hydrofilowa i pozostaje wewnątrz komórki. W ten
akworyny jest za to sam fakt, że jest ona białkiem. Jej se-
sposób wystarczy dodać formy acetylometylowej barwnika
kwencja aminokwasowa może być modyfikowana tak, by
(w tym wypadku zwie siÄ™ ona Quin-2 AM) do hodowli ko-
białko trafiało do określonych przedziałów komórkowych.
mórek i poczekać, a sonda molekularna sama do nich wnik-
Ta ostatnia cecha pozwoliła, w trakcie ostatnich trzydzie-
nie [13]. Ten genialny pomysł do dziś jest wykorzystywany
stu lat, na używanie akworyny tam, gdzie chemiczne sondy
z powodzeniem, gdyż wszystkie chemiczne sondy wapnio-
wapniowe nie docierają i gdzie stężenie jonów wapnia jest
we dziedziczą po EGTA cztery grupy karboksylowe, które
wysokie, a więc na przykład do jego monitorowania w sia-
można estryfikować grupą acetylometylową.
teczce śródplazmatycznej [10] lub w mitochondriach [11].
Niska wydajność spowodowała, że dziś z akworyną kon- Prócz zastosowania estrów acetylometylowych, wciąż
kurują sztuczne białka o funkcji sond wapniowych, których używane są inne metody wprowadzania sond chemicznych
sekwencje aminokwasowe zaprojektowano od podstaw, i do badanych komórek. W szeregu przypadków jedynym
które zostaną omówione w dalszej części rozdziału. rozwiązaniem jest mikroiniekcja, zwłaszcza w tych ko-
mórkach, które mają esterazy na zewnętrznej powierzch-
Podczas gdy akworyna powstała w trakcie milionów lat ni błony komórkowej lub płaszcza glikoproteinowego, jak
ewolucji, tak zwane chemiczne sondy wapniowe zostały na przykład wiele z pierwotniaków. W takich komórkach
skonstruowane przez człowieka. Wywodzący swą struk- grupy AM zostają odcięte przed przekroczeniem bariery,
turę od EGTA, Quin-2 (Ryc. 1) był pierwszym prawdziwie jaką stanowi błona lipidowa i jedynym sposobem na wpro-
funkcjonalnym, fluorescencyjnym zwiÄ…zkiem, zmienia- wadzenie czÄ…steczek hydrofilowych do cytoplazmy jest
jącym wydajność kwantową fluorescencji po związaniu bezpośrednie ich wstrzyknięcie [14]. Podczas badań elek-
jonu wapnia [12]. Aby sonda wapniowa była użyteczna trofizjologicznych stosuje się również wprowadzanie sond
jako narzędzie w biologii komórki należało znalez
ć metodę jonowych z wykorzystaniem pipet patch-clamp, co pozwala
wprowadzenia jej do cytoplazmy, pokonując barierę błony na jednoczesny pomiar błonowego równoległy pomiar stę-
plazmatycznej komórki. Taka metoda została opracowana żenia jonów wapnia w cytoplazmie i zjawisk elektrofizjo-
dwa lata po stworzeniu sondy Quin-2 i polegała na estryfi- logicznych na błonie komórkowej [15]. Pozostałe metody,
466 www.postepybiochemii.pl
takie jak poddawanie komórek szokowi osmotycznemu
[16], znacznym przeciążeniom [17] czy fuzja z pęcherzyka-
mi zawierającymi sondę [18] zostały zarzucone ze względu
na małą skuteczność i inwazyjność.
POmiary ratiOmetrycZne 
barWniki Fura i indO
Opisane w poprzednim rozdziale sondy wapniowe były-
by wystarczającymi narzędziami do badania sygnału wap-
niowego w komórkach, gdyby nie skutki fizjologiczne tego
sygnału. Jak napisano we wstępie, stężenie jonów wapnia
reguluje bardzo wiele procesów zachodzących w organi-
zmach. Do tych procesów należy między innymi regulacja
struktury i kurczliwości cytoszkieletu, czyli białkowej sieci
określającej kształt oraz mechaniczne własności komórki
(zagadnienie szeroko zostało opisane Postępach Biochemii
[19]).
Przez długi czas nie potrafiono odpowiedzieć na pytanie,
czy obserwowana zmiana jasności rejestrowanego obrazu
jest skutkiem wzrostu stężenia jonów wapnia, czy też może
rycina 2. Wydajność wzbudzenia sondy wapniowej Fura-2. Linia niebieska:
zmiany kształtu komórki powodują zmiany ilości barwni- wykres wzbudzania sondy w środowisku niezawierającym jonów wapnia. Linia
czerwona: wykres wzbudzania sondy wysyconej jonami wapnia. Linie jasno-
ka wrażliwego na obecność jonów wapnia w obserwowanej
niebieska, zielona, żółta i pomarańczowa: wykres wzbudzania mieszaniny nie-
objętości cytoplazmy. Problem ten został rozwiązany w po-
związanej sondy i sondy związanej z wapniem, dla stężenia wapnia w roztworze
odpowiednio: 50 nM, 100 nM, 500 nM i 2 µM. Dla Å›wiatÅ‚a wzbudzajÄ…cego 340 nm
Å‚owie lat osiemdziesiÄ…tych XX. wieku przez Rogera Tsiena,
jasność fluorescencji rośnie wraz ze wzrostem stężenia wapnia w roztworze, pod-
który opracował pierwszy barwnik ratiometryczny nazwa-
czas gdy dla światła wzbudzającego 380 nm intensywność fluorescencji sondy
ny Fura.1
spada wraz ze wzrostem stężenia wapnia w roztworze. Prezentowane wykresy
przedstawiają wartości obliczone dla Kd sondy dla wapnia jako ~225 nM, takiego
jak obserwujemy w cytoplazmie komórek ze względu na obecność jonów ma-
ZASADA DZIAłANIA BARWNIKóW
gnezu w roztworze, w odróżnieniu od większości wykresów dostępnych w sieci,
RATIOMETRYCZNYCH
sporzÄ…dzonych eksperymentalnie in vitro przy Kd ~150 nM. IB: punkt izobastycz-
ny, 360 nm.
SondÄ™ wapniowÄ… w roztworze cytoplazmatycznym mo-
żemy traktować jako mieszaninę dwóch barwników flu-
orescencyjnych: czÄ…steczek sondy niezwiÄ…zanej z jonami
wapnia i cząsteczek sondy w kompleksie z jonem wapnia. Fura-2 w stanie niezwiązanym świeci najjaśniej przy
Jasność fluorescencji dowolnego barwnika zależy od wydaj- wzbudzeniu falą światła o długością 362 nm, zaś w stanie
ności kwantowej fluorochromu (definiowanej jako stosunek związanym z jonem wapnia przy wzbudzeniu 335 nm. Jed-
liczby fotonów emitowanych do liczby fotonów absorbo- nocześnie wydajność kwantowa barwnika wzrasta wraz ze
wanych) oraz stężenia barwnika. Podczas gdy wydajność związaniem jonu wapnia z 0,23 do 0,49 (Ryc. 2). Na rycinie
kwantowa jest właściwością barwnika, to lokalne stężenie widać różnicę między wykresem wydajności wzbudzania
sondy wapniowej może się zmieniać w trakcie pomiaru i niezwiązanego barwnika (linia niebieska) i barwnika zwią-
jest trudne do kontrolowania. Jeśli sonda zmienia pod zanego z wapniem (linia czerwona), a także szereg linii po-
wpływem wiązania jonu wapnia swoją wydajność kwan- kazujących przebieg wykresu dla mieszaniny tych dwóch
tową, to trudno jest odróżnić sytuację, w której pojawia form sondy. Rzucającą się woczy cechą tego wykresu jest
się w roztworze więcej jonów wapnia od sytuacji, w której istnienie punktu izobastycznego, w którym wydajność
pojawia się w roztworze więcej cząsteczek barwnika. Aby wzbudzania sondy nie zależy od tego, czy kompleksuje ona
taką różnicę dostrzec, trzeba skorzystać z sondy, która pod jon wapnia czy nie. Ten punkt znajduje się przy długości
wpływem kompleksowania jonu wapnia zmienia inną ce- fali 360 nm. Dla wzbudzenia falą krótszą, sonda świeci co-
chę niż wydajność kwantowa fluorescencji. Pierwszymi raz jaśniej wraz ze wzrostem liczby cząsteczek barwnika
takimi związkami, do dziś z powodzeniem używanymi w kompleksujących wapń, a dla długości fali wzbudzającej
badaniach, były opisane przez grupę Tsiena w roku 1985 powyżej 360 nm, jasność fluorescencji sondy spada wraz
Fura-2 i Indo-1, [20]. Na skutek kompleksowania jonu wap- ze wzrostem odsetka czÄ…steczek kompleksujÄ…cych jon wap-
nia następuje w nich przesunięcie optimum wzbudzenia nia. Grynkiewicz i Tsien wykazali w 1985 roku, że stosunek
(Fura 2) lub emisji (Indo 1). jasności fluorescencji sondy wzbudzanej przy długości fali
światła 340 nm do jasności fluorescencji wzbudzanej świa-
tłem 380 nm nie zależy od stężenia barwnika, a jedynie stę-
1
Termin  ratiometria jest bezpośrednim i niezbyt szczęśliwym zapo-
żenia wapnia i przedstawia się wzorem (1):
życzeniem z języka angielskiego. Oznacza technikę pomiaru opartą o
stosunek dwóch mierzonych wartości. Termin ten jest wcześniejszy
(1)
niż jego biologiczne wykorzystanie i pochodzi z elektroniki. Rozpo-
wszechnił się w wielu językach (np. w języku niemieckim), gdzie tak
jak w polskim nie ma logicznego uzasadnienia. Autor nie czuje siÄ™ po-
gdzie: [Ca2+]  stężenie wapnia, Kd  stała dysocjacji kom-
wołany do toczenia batalii o czystość języka i będzie tego terminu w
pleksu jon wapnia  Fura-2, R  stosunek fluorescencji
bieżącym artykule używał.
Postępy Biochemii 58 (4) 2012 467
340/380 nm, Rmin  stosu- tych parametrów dzielą się na dwie podstawowe grupy: in
tabela 1. Sondy wapniowe z rodzi-
ny Fura charakteryzują się różnym nek R rejestrowany w roz- vivo oraz in vitro.
powinowactwem do jonów wapnia
tworze nie zawierajÄ…cym
Metoda in vitro polega na sporzÄ…dzeniu szeregu roztwo-
(Kd podane dla roztworu wodnego w
jonów wapnia, Rmax  sto-
nieobecności innych jonów). Na pod-
rów o znanym stężeniu jonów wapnia zawierających son-
stawie materiałów producenta (Life sunek R rejestrowany w
dę wapniową Fura-2, a następnie dokonania pomiaru flu-
Technologies).
roztworze wysyconym
orescencji tej serii roztworów przy dwóch długościach fali
jonami wapnia, Q  para-
Sonda Kd(Ca2+)
wzbudzajÄ…cej 340 nm i 380 nm. Seria rozpoczyna siÄ™ roz-
metr określający dynamikę
Fura-2 140 nM
tworem EGTA (całkowicie pozbawionym jonów wapnia), a
sprzętu pomiarowego, bę-
Fura-5F 400 nM kończy roztworem nasyconym jonami wapnia (w przypad-
dący stosunkiem jasności
Fura-4F 770 nM ku barwnika Fura-2, jest to roztwór soli wapnia w stężeniu
fluorescencji rejestrowanej
Fura-6F 5,30 µM milimolowym). Te dwa graniczne roztwory pozwalajÄ… okre-
w roztworze wysyconym
Fura-FF 5,50 µM Å›lić Rmin oraz Rmax wystÄ™pujÄ…ce we wzorze Grynkiewicza. Se-
wapniem do fluorescencji
Mag-Fura-2 25 µM ria roztworów o stężeniach poÅ›rednich pozwala natomiast
w roztworze pozbawio-
na dopasowanie nieco zmodyfikowanego wzoru Grynkie-
nym wapnia, przy długości
wicza do otrzymanych wyników. Modyfikacja ta polega na
światła wzbudzającego 380 nm. We wzorze tym nie wystę-
wprowadzeniu parametru Keff, będącego ilorazem Kd i Q.
puje nigdzie stężenia sondy wapniowej, co zostało wyja-
śnione w krótkim wyprowadzeniu wzoru w ramce.
Podstawową wadą metody kalibracji in vitro jest możli-
Oprócz barwnika Fura-2, opracowano całą gamę podob- wa różnica między Kd sondy wapniowej w komórce i roz-
nych związków, różniących się powinowactwem do jonów tworze kalibracyjnym. Wiadomo, że Kd barwnika Fura-2 dla
wapnia. Ich lista przedstawiona jest w tabeli 1. wapnia zmienia się w zależności od szeregu czynników,
głównie obecności magnezu i siły jonowej roztworu [21].
KALIBRACJA BARWNIKA FuRA-2
(2)
Jeśli stosunek jasności dwóch obrazów fluorescencyjnych
ma zostać przeliczony na stężenie jonów wapnia w cytopla-
zmie komórki (Ryc. 3), to wymagane jest określenie para- Aby wyeliminować te dodatkowe czynniki, częściej
metrów, które zostały określone we wzorze Grynkiewicza, stosuje się metodę in vivo. Polega ona na odczytaniu pa-
a które opisano i wyjaśniono powyżej. Metody określenia rametrów równania Grynkiewicza bezpośrednio na pod-
stawie obserwacji badanych komórek. Metoda ta opiera
siÄ™ na zastosowaniu antybiotyku jonomycyny (lub innego
jonoforu, pozwalającego na swobodny przepływ jonów
wapnia między środowiskiem komórki a cytoplazmą)
w celu kontrolowanej modyfikacji cytoplazmatycznego
stężenia jonów wapnia [22,23]. Podanie jonoforu powo-
duje napływ jonów wapnia ze środowiska zewnątrzko-
mórkowego i wysycenie sondy wapniowej, co pozwala
na określenie wartości Rmax. Następnie do roztworu poda-
wane jest EGTA i po ustaleniu się równowagi chemicznej
można odczytać wartość Rmin. Posiadając dane cząstkowe
(obrazy dla wzbudzenia 340 nm i 380 nm), potrzebne do
obliczenia każdego ze stosunków możemy także poli-
czyć współczynnik Q. Do obliczeń używa się średnich
ze znaczącej liczby komórek, by uniknąć wpływu fluk-
tuacji jasności obrazu. Przy zastosowaniu metody in vivo
nie można niestety określić bezpośrednio wartości Kd
sondy w cytoplazmie. Do tego potrzebny jest trzeci bu-
for kalibracyjny o znanym stężeniu jonów wapnia [24].
Obecność wewnątrzkomórkowych, białkowych buforów
wapnia może jednak powodować, że ustalenie się równo-
wagi chemicznej i idÄ…ca za tym stabilizacja poziomu flu-
orescencji sondy będą trwać niepraktycznie długo. Alter-
rycina 3. Zasada ratiometrycznego obrazowania stężenia jonów wapnia w cyto-
natywą jest więc założenie a priori wartości Kd sondy. Jest
plazmie, pokazana na przykładzie działania jonomycyny na komórki glejaka C6.
Lewa kolumna (A, B, C): komórki w środowisku hodowlanym zawierającym 2
to często przyjmowany kompromis między dokładnością
mM stężenie jonów wapnia, prawa kolumna (D, E, F): komórki po podaniu jono-
kalibracji a praktycznymi ograniczeniami eksperymentu.
mycyny do środowiska. Górny wiersz (A, D): obraz otrzymany przy wzbudzeniu
sondy światłem 380 nm, jaśniejszy dla niskiego poziomu wapnia związanego z Najczęściej przyjmowaną wartością jest 225 nM, wartość
sondą, widać spadek jasności po podaniu jonomycyny. Wiersz środkowy (B, E):
określona przez Grynkiewicza i Tsiena dla 1 mM stężenia
obraz otrzymany przy wzbudzeniu sondy światłem 384 nm, jaśniejszy dla wyso-
jonów magnezu w środowisku [20]. Trzeba pamiętać, że
kiego poziomu wapnia związanego z sondą, widać wzrost jasności po podaniu
jonomycyny. Dolny wiersz (C, F): mapa stężenia wapnia w cytoplazmie otrzyma- w trakcie kalibracji in vivo następuje nieodwracalne znisz-
na z równania Grynkiewicza. Wszystkie obrazy pokazano w fałszywej skali barw
czenie badanego materiału, co jest niewątpliwą wadą tej
dla lepszego zobrazowania zmian.
metody kalibracji.
468 www.postepybiochemii.pl
Skąd się wziął wzór Grynkiewicza
Załóżmy, że w naszym doświadczeniu sonda molekularna znajduje się w cytoplazmie w wystarczająco niskim stężeniu, żeby wydajność jej fluorescencji była pro-
porcjonalna do ilości wzbudzanego barwnika. Biorąc pod uwagę, że mamy w układzie dwa barwniki (sondę związaną z jonem wapnia i sondę bez jonów wapnia),
a każdy z nich wzbudzamy dwoma długościami światła (340 nm i 380 nm w przypadku barwnika Fura-2), w równaniach występować będą cztery współczynniki:
S340W dla niezwiązanego barwnika wzbudzanego światłem 340 nm
S340Ca dla barwnika kompleksującego jon wapnia wzbudzanego światłem 340 nm
S380W dla niezwiązanego barwnika wzbudzanego światłem 380 nm
S380Ca dla barwnika kompleksującego jon wapnia wzbudzanego światłem 380 nm
Współczynniki te zależeć będą od wydajności kwantowej każdej z form sondy oraz własności układu optycznego, takich jak intensywność wzbudzania, wydajność
używanego detektora itd. Obserwowana jasność fluorescencji będzie więc wyglądała następująco:
F340W = S340W Cw + S340Ca CCa (1a)
F380W = S380W Cw + S380Ca CCa (1b)
gdzie Cw i CCa to odpowiednie stężenia niezwiązanej i związanej z wapniem sondy. Z tych wzorów możemy policzyć R, stosunek jasności fluorescencji przy dwóch
falach wzbudzajÄ…cych:
(2)
Stężenia niezwiązanej i związanej formy sondy są ze sobą powiązane wzorem na kompleksowanie ze współczynnikiem stechiometrycznym 1:1:
(3)
gdzie [Ca2+] to stężenie wapnia w roztworze, a Kd to stała dysocjacji sondy dla jonów wapnia. Podstawiając wzór (3) do wzoru (2) otrzymujemy:
(4)
Cw można skrócić otrzymując równanie w którym R nie zależy od stężenia sondy!:
(5)
Jeśli teraz przekształcimy równanie, tak by mogło ono posłużyć do obliczenia stężenia wapnia w roztworze, dostajemy znane równanie Grynkiewicza:
(6)
gdzie łatwo eksperymentalnie możemy zmierzyć jako R dla roztworu bez jonów wapnia i oznaczyć jako Rmin, a jako R dla roztworu
wysyconego
jonami wapnia i oznaczyć jako Rmax. Stosunek określa parametr związany z własnościami używanego systemu do pomiarów optycznych i jest
określony w czasie kalibracji takiego systemu. Zazwyczaj określamy go jako Q. Stąd bierze się najczęściej spotykana forma równania:
barWniki nieratiOmetrycZne trycznych. Jeśli natomiast powyższe założenia są prawdzi-
W mikrOSkOPii kOnFOkalnej
we, pomiar nieratiometryczny jest szybki i prosty.
Równolegle do rozwoju sond ratiometrycznych praco- Pierwsza grupa barwników nieratiometrycznych po-
wano nad sondami, które podobnie jak Quin-2 zmieniają wstała z fluoresceiny i rodaminy, a wywodząca się z nich
jedynie wydajność kwantową. Znalazły one zastosowanie rodzina sond Fluo jest do dziś używana [25]. Rozwój barw-
w mikroskopii konfokalnej relatywnie grubych obiektów ników Fluo, od Fluo-2 do Fluo-4 polegał na zwiększaniu
biologicznych, takich jak duże komórki czy skrawki tkanek. wydajności kwantowej sondy oraz zwiększaniu dynamiki
Mikroskop konfokalny jest w stanie nieinwazyjnie wyci- reakcji na wiązanie wapnia. Opracowano również warianty
nać woksele, czyli prostopadłościenne fragmenty objętości
tabela 2. Sondy wapniowe z rodziny Fluo. y
ródła: materiały producentów (Life
obserwowanego preparatu i dokonywać w nich pomiaru
Technologies, AAT Bioquest [25,26]).
jasności fluorescencji. Jako, że woksel z definicji zawsze za-
Stosunek jasności barwnika
chowuje tę samą objętość, przy pewnej ostrożności można
Sonda Kd(Ca2+)
nasyconego do niezwiÄ…zanego
dokonywać w nim nieratiometrycznego pomiaru stężenia
Fluo-2 370 nM 31
jonów wapnia. Pierwszym warunkiem poprawnego pomia-
Fluo-3 390 nM 40
ru nieratiometrycznego jest to, że nie zmieni się charakter
Fluo-4 350 nM 54
woksela, czyli np. nie znajdzie siÄ™ na skutek skurczu ko-
Fluo-5F 2,3 µM 
mórki w jądrze komórkowym. Drugim warunkiem jest to,
Fluo-5N 90 µM 
że woksel przez cały czas znajduje się w całości wewnątrz
Fluo-4FF 9,7 µM 
badanej komórki. Oznacza to, że gdy objętość woksela jest
Fluo-8 390 nM 200
większa niż objętość badanej struktury, co ma miejsce na
Fluo-8H 230 nM 
przykład podczas obserwacji brzegu komórki  cienkie-
Fluo-8L 1,9 µM 
go lamellipodium, nie można stosować metod nieratiome-
Postępy Biochemii 58 (4) 2012 469
BIAłKA FLuORESCENCYJNE WRAżLIWE
tabela 3a. Właściwości fluorescencyjne sond z rodziny Calcium Green. Na pod-
NA STężENIE JONóW WAPNIA
stawie materiałów producenta (Life Technologies, [27]).
Białka fluorescencyjne wrażliwe na stężenie wapnia po-
Długość światła Długość światła
Sonda
chodzą wszystkie od zielonego białka fluorescencyjnego
wzbudzajÄ…cego emitowanego
GFP. Oryginalny Cameleon, skonstruowany w laboratorium
Calcium Green 488 nm 530 nm
Rogera Tsiena, był białkiem składającym się z chromoforu-
Calcium Orange 530 nm 575 nm
-donora (CFP, niebieskiej pochodnej GFP), kalmoduliny,
Calcium Crimson 570 nm 610 nm
łącznika, domeny M13 wiążącej kalmodulinę pochodzącej z
kinazy lekkich łańcuchów miozyny i chromofora akceptoro-
tabela 3b. Charakterystyka wiÄ…zania wapnia przez sondy z grupy Calcium
wego (YFP, żółtej pochodnej GFP) [28]. Po związaniu wap-
Green. Na podstawie materiałów producenta (Life Technologies, [27]).
nia przez kalmodulinę, zwiększało się jej powinowactwo do
Sonda Kd(Ca2+)
domeny pochodzącej z kinazy lekkich łańcuchów miozyny
Calcium Green-1 190 nM
i cała cząsteczka ulegała zmianie konformacji tak, że białka
Calcium Green-5N 14 µM
fluorescencyjne zbliżały się do siebie pozwalając na niepro-
Calcium Green-2 550 nM
mienisty transfer energii (FRET, ang. Fluorescence Resonan-
Oregon Green 488 BAPTA-1 170 nM
ce Energy Transfer, czasem rozwijany jako Förster Resonance
Oregon Green BAPTA-6F 3 µM
Energy Transfer) między CFP a YFP (Ryc. 4A).
Oregon Green BAPTA-5N 20 µM
Oregon Green BAPTA-2 580 nM
Od czasu opracowania pierwszej sondy Cameleon nastÄ…-
Calcium Orange 320 nM
pił lawinowy wzrost liczby podobnych białek, przebiegają-
Calcium Crimson 200 nM
cy w dwóch kierunkach: poprawienia właściwości fluore-
sondy Fluo charakteryzujące się różnym powinowactwem
Ca
do wapnia, tak by badać różne stężenia jonów (patrz Tab.
2). Ostatnio opracowano barwnik Fluo-8, charakteryzujÄ…cy
się bezprecedensową jasnością i dynamiką. Niestety jest on
dość wrażliwy na zmiany pH cytoplazmy, co utrudnia jego
użycie jako narzędzia do fizjologicznego pomiaru stężenia
A
Ca
jonów wapnia [26].
Druga grupa nieratiometrycznych sond wapniowych
Ca
pochodzi z firmy Molecular Probes i jest oparta na bardzo
jasnym barwniku fluorescencyjnym Oregon Green. Mody-
fikacje tej grupy związków poszły w dwóch kierunkach:
zmiany długości fali światła wzbudzającego (Tab. 3a) oraz,
tak jak w przypadku innych sond wapniowych, zmiany po-
B
Ca
winowactwa do jonów wapnia (Tab. 3b). Pierwszy kierunek
zaowocował barwnikami: Calcium Orange wzbudzanym
falą o długości 530 nm i Calcium Crimson wzbudzanym falą
Ca
o długości 570 nm [27]. Barwnik Calcium Green jest bardzo
jasny (wydajność kwantowa 0,75 wobec 0,14 w przypadku
Fluo-3), może więc być używany w mniejszych stężeniach,
co prowadzi do jego mniejszej cytotoksyczności, która sta-
nowi poważny problem przy konfokalnym obrazowaniu
C
Ca
stężenia wapnia. Niestety zarówno Calcium Orange jak i
Calcium Crimson majÄ… niewielkÄ… dynamikÄ™, co utrudnia ich
rycina 4. A: Schemat działania białkowej sondy wapniowej opartej o zjawisko
FRET. Białko niezwiązane z wapniem znajduje się w konformacji rozwiniętej,
praktyczne zastosowanie.
grupy chromoforowe CFP i YFP znajdują się z dala od siebie. Wzbudzenie białka
fioletowo-niebieskim światłem o długości fali 435 nm powoduje emisję niebie-
białkOWe SOndy WaPniOWe
skiego światła o długości fali 480 nm. Po związaniu wapnia białko ulega zmia-
nie konformacyjnej, w której wyniku chromofory CFP i YFP znajdują się bardzo
blisko, co umożliwia zajście zjawiska niepromienistego transferu energii między
GrupÄ™ kodowanych genetycznie sond wapniowych
nimi. Po wzbudzeniu światłem 435 nm białko zaczyna emitować światło żółte o
otwiera oczywiście akworyna, niemniej musiało minąć długości fali 535 nm. B: schemat działania białkowej sondy wapniowej opartej o
aktywację pojedynczej domeny białka fluorescencyjnego. Domena chromoforo-
dwadzieścia lat, by białka luminescencyjne i fluorescen-
wa białka podzielona jest na dwie niezależne części, które pod nieobecność wap-
cyjne stały się użytecznym narzędziem obrazowania stę-
nia w roztworze znajdują się na dwóch końcach cząsteczki. Dopiero związanie
żenia jonów wapnia w komórce. Ostatnie dziesięciolecie wapnia powoduje zwinięcie łańcucha peptydowego i utworzenie funkcjonalnej
domeny chromoforowej białka. C: Schemat działania sondy molekularnej opar-
jest świadkiem burzliwego rozwoju tej grupy sond wap-
tej o zjawisko BRET. W nieobecności jonów wapnia podzielona na dwie części
niowych i jej znaczącej dywersyfikacji. Białkowe sondy
domena bioluminescencyjna, jest nieaktywna. Po związaniu wapnia następuje
zmiana konformacji białka i domena zostaje uaktywniona. Znajduje się ona te-
wapniowe można podzielić dziś na dwie podstawowe
raz w sÄ…siedztwie domeny z grupy CFP, stanowiÄ…cej akceptor niepromienistego
grupy: fluorescencyjne [28] i bioluminescencyjne (czasem
transferu energii z centrum aktywnego domeny bioluminescencyjnej. Domena
też określane jako chemiluminescencyjne), do których na-
CFP jest wydajniejszym od białek bioluminescencyjnych emiterem fotonów i sta-
nowi wzmacniacz sygnału świetlnego.
leży akworyna.
470 www.postepybiochemii.pl
scencyjnych barwnika oraz stworzenia grupy sond o zróż-
Białkowe sondy wapniowe podążają zatem za sondami
nicowanych wartościach Kd dla wapnia, co pozwoliłoby na
drobnocząsteczkowymi. ustępują im na razie dynamiką
pomiary stężenia jonów wapnia w różnych przedziałach
i wygodą użycia, pozwalają za to na selektywne wprowa-
komórki [29]. Powstało także wiele sztucznie tworzonych
dzanie do określonych typów komórek jak i nakierowanie
białek, opartych o tę samą zasadę: FRET pomiędzy dwoma
na określone przedziały wewnątrzkomórkowe. Okazują się
chromoforami, których pozycja przestrzenna zmienia się w
także niezastąpione przy badaniach in vivo w całych orga-
zależności od obecności jonów wapnia w środowisku.
nizmach.
Aby osiągnąć różne powinowactwo do jonów wapnia,
BIAÅ‚KOWE SONDY WAPNIOWE OPARTE
skonstruowana została rodzina Cameleon ów oznaczonych
O ZJAWISKO BIOLuMINESCENCJI
jako YC (od ang. Yellow Cameleon) z odpowiednim numerem.
I tak mamy YC2, z natywną sekwencją aminokwasową kal- Rozwój optogenetyki spowodował powrót do prac nad
moduliny, charakteryzujący się dwufazowym wiązaniem jo- udoskonaleniem sond bioluminescencyjnych, które do
nów wapnia i pozwalający na pomiar w zakresie 100 nM 10 działania nie potrzebują światła wzbudzającego. Burzliwy
µM. YC3 ma zamienionÄ… resztÄ™ aminokwasowÄ… w pozycji 104 rozwój tej metody w neurobiologii wraz z niskÄ… wydajno-
(reszta glutaminy zamiast kwasu glutaminowego), co nieco ścią akworyny, która dyskwalifikuje ją jako sondę do badań
zmniejsza powinowactwo i zakres pomiaru wynosi od 1 do in vivo, spowodował powstanie nowych sond białkowych
100 µM. YC4 ma takÄ… samÄ… mutacjÄ™ w pozycji 31 sekwencji zaprojektowanych tak, by zwiÄ™kszona byÅ‚a wydajność
aminokwasowej kalmoduliny, co daje znacznie niższe powi- kwantowa luminescencji. Taką metodą okazał się BRET
nowactwo do jonów wapnia i zakres pomiarowy od 10 µM do (ang. Bioluminescence Resonance Energy Transfer, czasem
1 mM [28]. Wadą tych barwników była wrażliwość na pH za- występujący też pod nazwą CRET, ang. Chemiluminescence
stosowanej domeny YFP, która powodowała, że zmiany pH Resonance Energy Transfer), czyli metoda niepromienistego
w środowisku wywoływały podobne zmiany fluorescencji przekazywania energii z luminoforu na znacznie wydaj-
jak zmiany stężenia jonów wapnia. Aby temu zaradzić wpro- niejszy emisyjnie chromorofor. Samo połączenie akworyny
wadzono zmiany w sekwencji aminokwasowej chromoforu, z białkiem GFP prowadziło do dziesięciokrotnego zwięk-
tworząc drugą generację sondy, oznaczaną jako YC2.1, YC3.1 szenia wydajności świetlnej sondy [41], co pozwoliło na
lub YC4.1 [30]. Dalsze prace w tym kierunku doprowadzi- obrazowanie mózgu muszki owocowej in vivo [42]. Jeszcze
Å‚y do zastÄ…pienia CFP mutacjÄ… zwanÄ…  citrine na poziomie wydajniejszÄ… sondÄ™ przedstawiono na Konferencji Europej-
trzeciej generacji białka (YC3.3) [31] i  venus na poziomie skiego Towarzystwa Wapniowego w 2012 roku (Takeharu
aktualnie najpopularniejszej, szóstej generacji białka Came- Nagai, plakat) gdzie hybrydowe białko składa się lucyfera-
leon (YC3.6) [32]. TrwajÄ… prace nad udoskonalaniem nowej zy (Rluc) podzielonej, przez nieujawnionÄ… sekwencjÄ… ami-
grupy sond z tej samej rodziny, oznaczanych odpowiednio nokwasową wiążącą wapń, na dwie subdomeny i wydajnej
D2cpv, D3cpv i D4cpv. Są one oparte na sztucznie zmody- wersji YFP. Podobnie jak w białkach fluorescencyjnych za-
fikowanych sekwencjach aminokwasowych, zaprojektowa- wierajÄ…cych podzielonÄ… sekwencjÄ™ GFP, zwiÄ…zanie wapnia
nych w ten sposób, by uniknąć oddziaływań poszczególnych powoduje powstanie funkcjonalnej lucyferazy, która przez
domen sondy z obecną w komórce kalmoduliną, czy też jej mechanizm BRET pobudza białko YFP do emisji fotonów.
partnerami [33]. Autorzy twierdzą, że tak skonstruowana sonda jest od pięć-
dziesięciu do stu razy wydajniejsza od akworyny i pozwala
W celu poprawienia siły składania cząsteczki po zwią- na obrazowanie aktywności neuronalnej w czasie rzeczywi-
zaniu jonu wapnia, w miejsce domeny z kinazy lekkich stym (Ryc. 4C).
łańcuchów miozyny inne grupy badaczy zastosowały od-
PerSPektyWy
mienne domeny białek pozwalające na osiągnięcie tego
samego efektu, np. w miejsce domeny z kinazy lekkich
łańcuchów miozyny użyto domenę z zależnej od kalmodu- Trzydzieści lat rozwoju technik optycznego pomiaru po-
liny kinazy kinaz białkowych (CaMKK) [34]. Kalmodulina ziomu jonów wapnia stworzyło dojrzałą dziedzinę metodo-
jako element wiążący wapń, w białkowych wskaz
nikach logii nauk biologicznych, dysponujÄ…cÄ… bezprecedensowym
stężenia tego jonu ma dość zasadniczą wadę: może ulec spektrum metod i narzędzi. Mimo, że używane dziś drob-
fosforylacji, która znosi czułość sondy [35]. W praktyce nocząsteczkowe sondy wapniowe mają szereg wad, takich
okazało się również, że białka oparte o kalmodulinę często jak konieczność użycia podwójnego wzbudzania barwnika
nie wykazują aktywności, jak to ma miejsce na przykład Fura-2, z przyczyn praktycznych nie należy spodziewać
w organizmach myszy [36]. Aby uniknąć tego problemu, się dalszego, szybkiego rozwoju tych technik. Szerokie wy-
skonstruowano analogiczne do kameleona białko TN-XL korzystanie posiadanych możliwości i brak zasadniczych
oparte o troponinę C [37] i charakteryzujące się większą postępów w ostatnim dziesięcioleciu powodują, że trudno
stabilnością w organizmie gospodarza. Ponadto, jako al- byłoby oczekiwać znaczących inwestycji ze strony produ-
ternatywę dla sond opartych o zjawisko FRET powstały centów czy agencji rządowych finansujących badania, a w
barwniki takie jak camgaroo-2 [38], CaMP2 [39] czy Pe- konsekwencji przełom jest mało prawdopodobny.
ricam [40], wykorzystujące pojedynczą cząsteczkę biał-
ka fluorescencyjnego. Sondy te działają przez składanie Szybszy postęp charakteryzuje rozwój genetycznie kodo-
dwóch elementów domeny fluorescencyjnej w całość pod wanych sond białkowych, choć i ta dziedzina zaczyna nabie-
wpływem związania jonów wapnia. Z tej perspektywy rać znamion dojrzałej. Wydaje się, że w najbliższym czasie
można je uznać na nieratiometryczną wersję białkowych czeka nas raczej doskonalenie istniejących produktów i ich
sond wapniowych (Ryc. 4B). komercjalizacja, niż przełomy związane z powstawaniem
Postępy Biochemii 58 (4) 2012 471
11. Rizzuto R, Brini M, Bastianutto C, Marsault R, Pozzan T (1995) Photo-
nowych rozwiązań, fundamentalnie innych od tych białek,
protein-mediated measurement of calcium ion concentration in mito-
które już znamy. Przewidywać za to można intensywny
chondria of living cells. Methods Enzymol 260: 417-428
rozwój technicznych metod obrazowania, pozwalających
12. Tsien RY (1980) New calcium indicators and buffers with high selec-
na zastosowanie istniejących rozwiązań w badaniach in
tivity against magnesium and protons: design, synthesis, and proper-
vivo, zwłaszcza w obszarze neurofizjologii i badań nad ko-
ties of prototype structures. Biochemistry 19: 2396-2404
mórkami nowotworowymi. Rozwój ten będzie tym szybszy
13. Tsien RY, Pozzan T, Rink TJ (1982) Calcium homeostasis in intact lym-
im prędzej uda się połączyć pomiary stężenia jonów wapnia
phocytes: cytoplasmic free calcium monitored with a new, intracellu-
z użyciem burzliwie się rozwijających metod optogenetyki.
larly trapped fluorescent indicator. J Cell Biol 94: 325-334
14. KÅ‚opocka W, Pomorski P (1996) Cytoplasmic calcium transients in
Drugim, obiecujÄ…cym kierunkiem rozwoju sond wapnio-
Amoeba proteus during induction of pinocytotic and non-pinocytotic
wych będzie rozpowszechnianie się drobnocząsteczkowych
rosettes. Acta Protozool 35: 169-180
sond kierowanych, takich jak FLAsH calcium green, będą-
15. Barcenas-Ruiz L, Wier WG (1987) Voltage dependence of intracellular
cy drobnoczÄ…steczkowÄ… sondÄ… z dwunasto aminokwaso-
[Ca2+]i transients in guinea pig ventricular myocytes. Circ Res 61: 148-
wÄ… metkÄ… tetra cysteinowÄ…, przeznaczony do znakowania
154
białek transgenicznych in vitro. Metodyka ta pozwala na
16. Borle AB, Snowdowne KW (1982) Measurement of intracellular free
bardzo lokalne pomiary stężenia jonów wapnia w bezpo-
calcium in monkey kidney cells with aequorin. Science 217:252-254
średnim otoczeniu dowolnego białka, na przykład kanału
17. Borle AB, Freudenrich CC, Snowdowne KW (1986) A simple method
jonowego [43]. Podobny cel przyświecał zespołowi, który
for incorporating aequorin into mammalian cells. Am J Physiol 251:
opracował metodę przyłączania barwnika Indo-1 do met- C323-326
ki SNAP, używanej do kowalencyjnego znakowania białek
18. Hallett MB, Campbell AK (1980) uptake of liposomes containing the
photoprotein obelin by rat isolated adipocytes. Adhesion, endocytosis
fuzyjnych zwiÄ…zkami drobnoczÄ…steczkowymi [44]. Oba
or fusion? Biochem J 192: 587-596
sztucznie utworzone peptydy pozwalajÄ… na lokalne pomia-
19. Pomorski P (2009) Regulacja migracji komórek przez jony wapnia.
ry in vitro, bezpośrednio na powierzchni interesujących ba-
Postepy Biochem 55: 163-170
dacza białek. Kwestią przyszłości jest, czy metodologia ta
20. Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY (1985) A new generation of Ca2+
sprawdzi się w żywych komórkach.
indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem
260: 3440-3450
Już dziś jednak można powiedzieć, że instrumentarium,
21. uto A, Arai H, Ogawa Y (1991) Reassessment of Fura-2 and the ra-
którym dysponują badacze mechanizmów fizjologicznych
tio method for determination of intracellular Ca2+ concentrations. Cell
modulowanych przez zmiany stężenia jonów wapnia w
Calcium 12: 29-37
komórkach jest bezprecedensowe i stawia ich na pozycji
22. Deber CM, Tom-Kun J, Mack E, Grinstein S (1985) Bromo-A23187: a
uprzywilejowanej w porównaniu z badaczami innych szla-
nonfluorescent calcium ionophore for use with fluorescent probes.
ków przekazywania sygnałów. Można domniemywać, że Anal Biochem 146: 349-352
ta łatwość pomiaru ma wspólne podłoże z uniwersalnością
23. Liu C, Hermann TE (1978) Characterization of ionomycin as a calcium
jonów wapnia jako regulatora funkcji materii ożywionej. ionophore. J Biol Chem 253: 5892-5894
Pozostaje mieć nadzieję, że kreatywność badaczy pozwoli
24. Almers W, Neher E (1985) The Ca signal from fura-2 loaded mast cells
na rozwój podobnych narzędzi do pomiaru wtórnych prze- depends strongly on the method of dye-loading. FEBS Lett 192: 13-18
kaz
ników innych szlaków sygnałowych, aktywnych w ko- 25. Minta A, Kao JP, Tsien RY (1989) Fluorescent indicators for cytosolic
calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. J Biol
mórkach i tkankach organizmów.
Chem 264: 8171-8178
26. Onimaru H, Dutschmann M (2012) Calcium imaging of neuronal ac-
PiśmiennictWO
tivity in the most rostral parafacial respiratory group of the newborn
1. Berridge MJ, Lipp P, Bootman MD (2000) The versatility and universa-
rat. J Physiol Sci 62: 71-77
lity of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol 1: 11-21
27. Eberhard M, Erne P (1991) Calcium binding to fluorescent calcium
2. Schwaller B (2010) Cytosolic Ca2+ buffers. Cold Spring Harb Perspect
indicators: calcium green, calcium orange and calcium crimson. Bio-
Biol 2: a004051
chem Biophys Res Commun 180: 209-215
3. Putney JW (2009) Capacitative calcium entry: from concept to molecu-
28. Miyawaki A, Llopis J, Heim R, McCaffery JM, Adams JA, Ikura M,
les. Immunol Rev 231: 10-22
Tsien RY (1997) Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluores-
4. Paredes RM, Etzler JC, Watts LT, Zheng W, Lechleiter JD (2008) Che-
cent proteins and calmodulin. Nature 388: 882-887
mical calcium indicators. Methods 46: 143-151
29. Krebs M, Held K, Binder A, Hashimoto K, Den Herder G, Parniske M,
5. Smetters D, Majewska A, Yuste R (1999) Detecting action potentials in
Kudla J, Schumacher K FRET-based genetically encoded sensors allow
neuronal populations with calcium imaging. Methods 18: 215-221
high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics. Plant J 69: 181-192
6. Yuste R, MacLean J, Vogelstein J, Paninski L (2011) Imaging action po-
30. Miyawaki A, Griesbeck O, Heim R, Tsien RY (1999) Dynamic and
tentials with calcium indicators. Cold Spring Harb Protoc 985-989
quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proc Natl
Acad Sci uSA 96: 2135-2140
7. Majkowski M, Wypych D, Pomorski P, Dzugaj (2010) A Regulation
of subcellular localization of muscle FBPase in cardiomyocytes. The
31. Griesbeck O, Baird GS, Campbell RE, Zacharias DA, Tsien RY (2001)
decisive role of calcium ions. Acta Biochim Pol 57: 597-605
Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein.
Mechanism and applications. J Biol Chem 276: 29188-29194
8. Shimomura O, Johnson FH, Saiga Y (1962) Extraction, purification and
properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous
32. Nagai T, Yamada S, Tominaga T, Ichikawa M, Miyawaki A (2004) Ex-
hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol 59: 223-239
panded dynamic range of fluorescent indicators for Ca2+ by circularly
permuted yellow fluorescent proteins. Proc Natl Acad Sci uSA 101:
9. Shimomura O, Johnson FH (1975) Regeneration of the photoprotein
10554-10559
aequorin. Nature 256: 236-238
33. Palmer AE, Giacomello M, Kortemme T, Hires SA, Lev-Ram V, Baker
10. Montero M, Brini M, Marsault R, Alvarez J, Sitia R, Pozzan T, Rizzuto
D, Tsien RY (2006) Ca2+ indicators based on computationally rede-
R (1995) Monitoring dynamic changes in free Ca2+ concentration in the
signed calmodulin-peptide pairs. Chem Biol 13: 521-530
endoplasmic reticulum of intact cells. EMBO J 14: 5467-5475
472 www.postepybiochemii.pl
vivo: Cardiac expression of the high-signal Ca2+ indicator GCaMP2.
34. Truong K, Sawano A, Mizuno H, Hama H, Tong KI, Mal TK, Miy-
Proc Natl Acad Sci uSA 103: 4753-4758
awaki A, Ikura M (2001) FRET-based in vivo Ca2+ imaging by a new
calmodulin-GFP fusion molecule. Nat Struct Biol 8:1069-1073
40. Nagai T, Sawano A, Park ES, Miyawaki A (2001) Circularly permuted
green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. Proc Natl Acad Sci
35. Benaim G, Villalobo A (2002) Phosphorylation of calmodulin. Functio-
uSA 98: 3197-3202
nal implications. Eur J Biochem 269: 3619-3631
41. Baubet V, Le Mouellic H, Campbell AK, Lucas-Meunier E, Fossier P,
36. Hasan MT, Friedrich RW, Euler T, Larkum ME, Giese G, Both M, Due-
Brulet P (2000) Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bio-
bel J, Waters J, Bujard H, Griesbeck O, Tsien RY, Nagai T, Miyawaki A,
luminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci
Denk W (2004) Functional fluorescent Ca2+ indicator proteins in trans-
uSA 97: 7260-7265
genic mice under TET control. PLoS Biol 2:e163
42. Martin JR, Rogers KL, Chagneau C, Brulet P (2007) In vivo biolumines-
37. Heim N, Griesbeck O (2004) Genetically encoded indicators of cellular
cence imaging of Ca signalling in the brain of Drosophila. PLoS One 2:
calcium dynamics based on troponin C and green fluorescent protein.
e275
J Biol Chem 279: 14280-14286
43. Tour O, Adams SR, Kerr RA, Meijer RM, Sejnowski TJ, Tsien RW,
38. Yu D, Baird GS, Tsien RY, Davis RL (2003) Detection of calcium tran-
Tsien RY (2007) Calcium Green FlAsH as a genetically targeted small-
sients in Drosophila mushroom body neurons with camgaroo report-
molecule calcium indicator. Nat Chem Biol 3: 423-431
ers. J Neurosci 23: 64-72
44. Bannwarth M, Correa IR, Sztretye M, Pouvreau S, Fellay C, Aebischer
39. Tallini YN, Ohkura M, Choi BR, Ji G, Imoto K, Doran R, Lee J, Plan P,
A, Royer L, Rois E, Johnsson K (2009) Indo-1 derivatives for local cal-
Wilson J, Xin HB, Sanbe A, Gulick J, Mathai J, Robbins J, Salama G,
cium sensing. ACS Chem Biol 4: 179-190
Nakai J, Kotlikoff MI (2006) Imaging cellular signals in the heart in
See the signal  methods for calcium imaging in the cell
PaweÅ‚ Pomorski1,2,*ð
1
Multimodal Laboratory for Cell Adhesion and Motility Research, NanoBioGeo Consortium, NanoFun Project, Nencki Institute of Experimental
Biology, 3 Pasteura str., 02-093 Warsaw, Poland
2
Laboratory of Molecular Basis of Cell Motility, Department of Biochemistry, Nencki Institute of Experimental Biology, 3 Pasteura str., 02-093
Warsawa, Poland
*ð
e-mail: [e-mail]
key words: calcium, signal transduction, imaging, microscopy
abStract
calcium ions are among the most universal secondary messengers existing in the living world. in the past thirty years the set of methods al-
lowing the calcium signal visualization have been developed. those in vivo methods allow us to observe the level of the free calcium ions
in cells, tissues and organisms. the following text presents calcium imaging research tools available today as well as the calcium imaging
methods and image calibration procedures.
Postępy Biochemii 58 (4) 2012 473