2011-03-24
Rodzaj metody pomiarowej
Praktyczna Nauka Zawodu
" Sygnał uzyskany w reakcji pomiarowej może być mierzony
Biochemia
dwoma sposobami:
" - w metodach punktu końcowego tzw.: end-point mierzony
Metody
jest poziom sygnału pomiarowego wytwarzanego przez
produkt reakcji wskaz
nikowej, który jest proporcjonalna do
Kinetyczne
ilości badanego związku.
" - w metodach typu  test spektrofotometryczny, kinetyczny
2010/2011 mierzona jest zmiana sygnału pomiarowego w czasie, a
różnica poziomu sygnału pomiędzy punktami pomiarowymi
Rok III semestr letni
jest proporcjonalna do stężenia lub aktywności badanego
Mgr Sylwia PÅ‚aczkowska, Mgr Izabela Kokot
zwiÄ…zku.
ZPNZA AM Wrocław
y
ródło: Podstawy diagnostyki laboratoryjnej. Akademia Medyczna im. Piastów Śląskich
Wrocław 2010r.
Rodzaj metody pomiarowej Rodzaj metody pomiarowej
Zasada metod kinetycznych Zasada metod kinetycznych
" W metodach kinetycznych śledzimy zmianę
absorbancji w czasie pomiaru, która
odzwierciedla ubytek lub przyrost substratu lub
WIELOKROTNY POMIAR
produktu w czasie przebiegu reakcji. ODCZYNNIK
SYGNA
U
" Z różnicy absorbancji na początku i końcu reakcji
INKUBACJA
wyznaczamy stężenie badanego związku,
OÅš CZASU
" Na podstawie zmiany absorbancji na minutÄ™
FAZA FAZA ODCZYTU SYGNAA
U
WST
PNA
pomiaru wyznaczamy szybkość reakcji i pośrednio
SUROWICA
aktywność oznaczanych enzymów.
1
2011-03-24
Przebieg testu kinetycznego Zasada metod kinetycznych
0,7
0,6
0,5
0,4
Przy maksymalnym wysyceniu enzymu
0,3
substratem w określonej jednostce czasu
0,2
przybywa tyle samo produktu. W efekcie daje
0,1
to przyrost absorbancji o stałą wartość w
0
0 20 40 60 80 100 120
określonej jednostce czasu.
czas pomiaru
Rodzaj krzywej kalibracyjnej Obliczanie faktora
Test kinetyczny/fix-time
- na podstawie krzywej wzorcowej,
0,8
0,7
która dla metod kinetycznych jest zależnością
0,6
szybkości reakcji ("A/min.) od aktywności
0,5
0,4 badanego enzymu.
0,3
0,2
0,1 W metodach rutynowych oznaczania aktywności
0
enzymów jest ona praktycznie nie stosowana ze
0 10 20 30 40 50 60 70
względu na nietrwałość i wysoki koszt wzorców.
Aktywność/Stężenie
Obliczanie faktora Molowy współczynnik absorbcji
- na podstawie molowego współczynnika absorpcji
dla produktu lub substratu reakcji wskaz
nikowej
W praktyce molowy współczynnik absorpcji
wyznacza się dla roztworów rozcieńczonych o
MOLOWY WSPÓA
CZYNNIK ABSORPCJI µ
stężeniu rzędu mili- lub mikromoli na litr,
ponieważ pomiar absorbancji dla roztworu o
to absorbancja roztworu zawierajÄ…cego 1
stężeniu rzędu moli na litr jest technicznie
mol/l barwnego zwiÄ…zku zmierzona w
niemożliwy.
kuwecie o grubości 1 cm.
2
absorbancja
"A (absorbancji)/min.
2011-03-24
Obliczanie faktora Jednostka aktywności enzymów
Konieczność podawania zmiany absorbancji na
VK Å"1000
minutę, nawet jeśli pomiary absorbancji
F =
µ Å"VP Å"1
prowadzone są w czasie dłuższym oraz
wyliczenie faktora, który odnosi się do
objętości litra badanego materiału wynika z
Gdzie:
F - faktor
definicji międzynarodowej jednostki
VK - objętość końcowa w ml
aktywności IU.
VP  objętość początkowa w ml
µ  współczynnik molowy dla mierzonego barwnego produktu
1000  współczynnik dla przeliczenia objętości z ml na litry
Metodyka Fix-Time
Metodyka Fix-Time
(metody substratowe) (metody substratowe)
" Metodyka tych pomiarów jest identyczna jak
dla metod kinetycznych, wartością oznaczaną
nie jest jednak szybkość reakcji, lecz zmiana
absorbancji.
" Pomiary absorbancji wykonywane sÄ…
dwukrotnie; pierwszy raz na poczÄ…tku i drugi
raz na końcu read time
Etapy testu kinetycznego TEST OPTYCZNY WARBURGA
" Każdy test kinetyczny składa się z dwóch faz:
20
" - faza wstępna (lag time), w czasie której reakcja
pomiarowa osiÄ…ga V max; jest to czas od chwili
15
dodania do odczynników materiału badanego, aż
NAD
10
do momentu rozpoczęcia pomiarów
NADH+H
" - faza pomiarowa (read time), w której w
5
określonych odstępach czasowych dokonywane
są pomiary absorbancji, na podstawie których
0
240 260 280 300 320 340 360 380 400 420
obliczana jest szybkość reakcji.
długość fali
3
absorbancja
2011-03-24
TEST OPTYCZNY WARBURGA
4