Ćwiczenie 6 (MOiŚ)
T: Pożywki bakteriologiczne
1. Podłoża proste
a) bulion zwykły
b) agar zwykły
2. Podłoża wzbogacone
a) p. na wyciągu mózgowo  sercowym (BHI  brain-heart infusion)
b) podłoże agarowe z krwią
c) bulion cukrowy
3. Podłoża namnażająco  wybiórcze
a) bulion z żółcią
b) p. Sabouraud
4. Podłoża różnicująco - wybiórcze
a) p. Chapmana
b) p. EMB (Levine a)
c) p. McConkey a
5. Cechy dobrej pożywki:
a) A
atwo dostępne z
ródła pierwiastków biogennych (C , O, H, N)
z
ródło azotu:
·ð pepton (w formie proszku; hydrolizat biaÅ‚ek - kazeiny lub biaÅ‚ek roÅ›linnych;
białka trawione trypsyną, chymotrypsyną, pepsyną i HCl  pozostają krótkie
oligopeptydy) 0,5-2%
·ð sole amonowe
·ð N2 (dla bakterii redukujÄ…cych azot atmosferyczny)
·ð ekstrakt drożdżowy (bogate z
ródło substancji odżywczych)
·ð ekstrakty miÄ™sne (dziÅ› dostÄ™pne od producentów w postaci pasty lub proszku,
dawniej odpowiednio spreparowane mięso bez ścięgien; bogate z
ródło:
mocznika, kreatyny, puryn, białek i aminokwasów, kwasów organicznych,
wit. z grupy B, soli mineralnych i innych substancji).
b) z
ródło energii (jak w pkt. a)
c) z
ródło elektronów (jak w pkt a)
d) sole mineralne (NaCl, ekstrakt mięsny, ekstrakt drożdzowy)
e) witaminy (ekstrakt mięsny, ekstrakt drożdżowy)
f) odpowiednie pH (obojętne lub zbliżone do obojętnego, maksymalnie 7,8)
miareczkowane przy pomocy NaOH lub HCl
g) ciśnienie osmotyczne odpowiadające 0,89% NaCl. Do pożywki dodaje się zwykle
0,5% NaCl, resztę modyfikują pozostałe składniki podłoża
UWAGA! podczas sterylizacji pH ulega obniżeniu o około 0,5 więc należy
odpowiednio zwiększyć w czasie przygotowywania pożywki
h) agar w przypadku pożywek stałych; ok. 2%
i) jałowość podłoża (uzyskiwana dzięki różnym technikom sterylizacji)
1. Podłoża proste
a) bulion zwykły
·ð wyciÄ…g miÄ™sny
·ð pepton 1%
·ð NaCl 0,5 %
·ð pH obojÄ™tne
·ð sterylizacja 121°C , 20 min.
b) agar zwykły
·ð tak jak bulion zwykÅ‚y + agar (ok 2%)
Ustalamy pH przed dodaniem agaru(!), rozpuszczamy w aparacie Kocha i
sterylizujemy (121 st. 20 min, 1 atm.)
2. Podłoża wzbogacone
d) p. na wyciągu mózgowo  sercowym (BHI  brain-heart infusion)
·ð hydrolizat z mózgów cielÄ™cych i serc woÅ‚owych
·ð glukoza 1%
·ð NaCl
·ð Pepton
·ð Agar (opcjonalnie)
Na tym podłożu bakterie rosną bardziej dynamicznie lub prowadzi się
hodowlÄ™ tych bardziej wymagajÄ…cych
e) podłoże agarowe z krwią
·ð substancja wzbogacajÄ…ca: krew ssacza (najczęściej krew barania, koÅ„ska,
ludzka 5%)
·ð pepton
·ð NaCl
Na tym podłożu można wstępnie określić pewne cechy hodowanych bakterii.
Jeżeli pojawia się przejaśnienie wokół kolonii (tzw. halo) oznacza to
zdolność bakterii do całkowitej hemolizy erytrocytów (hemoliza beta). Jeżeli
wokół kolonii pojawia się zazielenienie, świadczy to o zdolności utleniania
hemoglobiny do methemoglobiny (Fe2+ --------> Fe3+) (hemoliza alfa). Brak
jakiejkolwiek charakterystycznej reakcji czasem nazywany hemolizÄ… gamma.
Hemoliza Alfa: Streptococcus pneumoniae
Streptococcus mitis
Hemoliza Beta: Streptococcus pyogenes
Staphylococcus aureus
Bacillus cereus
f) bulion cukrowy
Składniki jak w bulionie zwykłym oraz dodatek 1% glukozy
3. Podłoża namnażająco  wybiórcze
Wpływają negatywnie na rozwój niektórych grup bakterii jednocześnie pozwalając na
rozwój innych.
g) bulion z żółcią
·ð 30% żółci  czynnik wybiórczy
·ð reszta jak w przypadku bulionu zwykÅ‚ego
Żółć występuje w przewodzie pokarmowym i obniża napięcie
powierzchniowe wody. Zwykle tylko bakterie jelitowe przeżywają na tym podłożu
(zarówno flora bakteryjna jak i patogeny). Podłoże wykorzystywane głównie do
wybiórczej hodowli bakterii z rodziny Enterobacteriaceae.
h) p. Sabouraud
·ð neopepton
·ð glukoza/maltoza
·ð agar
·ð pH 5-6  czynnik wybiórczy
Podłoże przeznaczone do hodowli grzybów. Bakterie nie rozwijają się na
podłożu o tak niskim pH.
4. Podłoża różnicująco - wybiórcze
i) p. Chapmana
·ð mannitol (czynnik różnicujÄ…cy)
·ð 7,5% NaCl (czynnik wybiórczy)
·ð pepton
·ð wyciÄ…g miÄ™sny
·ð czerwieÅ„ fenolowa (wskaz
nik)
Służy do hodowli gronkowców. Bakterie z rodzaju Staphylococcus mogą
rosnąć w dużym stężeniu NaCl podczas gdy inne bakterie nie rozwijają się na
takim podłożu. Jeżeli gronkowce rozkładają mannitol to dochodzi do
zakwaszenia podłoża. Zmienia ono barwę z malinowej na żółtą dzięki
wskaz
nikowi  czerwieni fenolowej. Gronkowce nie rozkładające mannitolu
nie zmieniają barwy podłoża.
Staphylococcus aureus  mannitolo +
S. epidermidis  mannitolo 
j) p. EMB (Levine a)
Eosin  methylen blue
·ð eozyna (wskaz
nik)
·ð bÅ‚Ä™kit metylenowy (czynnik wybiórczy)
·ð laktoza 1% (czynnik różnicujÄ…cy)
·ð sacharoza 1% (czynnik różnicujÄ…cy)
·ð pepton
Błękit metylenowy hamuje rozwój bakterii G+. Podłoże jest więc przeznaczone
przede wszystkim do hodowli bakterii z rodziny Enterobacteriaceae i innych
gramujemnych. Jeżeli bakterie rozkładają laktozę lub sacharozę to zakwaszają
podłoże i reaguje eozyna. Wtedy kolonie przyjmują barwę różową, fioletową lub
białą z fioletowym środkiem. E.coli tworzy na tym podłożu kolonie z
charakterystycznym, zielonkawym, metalicznym połyskiem.
E. coli, Klebsiella sp., Citrobacter  reakcja dodatnia
Salmonella sp, Shigella sp, Pseudomonas sp  są bezbarwne na tym podłożu
(reakcja ujemna).
k) p. McConkey a
·ð sole żółci (czynnik wybiórczy)
·ð fiolet krystaliczny (czynnik wybiórczy)
·ð laktoza (czynnik różnicujÄ…cy)
·ð czerwieÅ„ obojÄ™tna (wskaz
nik)
Bakterie rozkładające cukier (czynnik różnicujący) zakwaszają podłoże, i dzięki reagującemu
barwnikowi rosną w postaci czerwonych kolonii. Jeżeli drobnoustroje nie metabolizują laktozy to
tworzÄ… bezbarwne kolonie.
E. coli, Klebsiella sp., Citrobacter  reakcja dodatnia
Salmonella sp, Shigella sp, Pseudomonas sp  reakcja ujemna
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
OCENA CECH MORFOLOGICZNYCH KOLONII BAKTERYJNYCH
1) CECHY MORFOLOGICZNE KOLONII (określane tylko na podłożach prostych lub
wzbogaconych):
a) barwa
b) wielkość (średnica w mm)
c) kształt: okrągły, nieregularny
d) błyszczące lub matowe
e) wypukłe lub wyniosłe
f) brzegi: całobrzegie lub postrzępione
I) Agar zwykły
1) Bacillus subtilis
2) Bacillus cereus
II) Agar z krwiÄ…
1) Staphylococcus aureus
2) Staphylococcus epidermidis
3) Streptococcus pyogenes
4) Streptococcus mitis
5) B. subtilis
6) B. cereus
7) E. coli
8) Klebsiella pneumoniae
9) Proteus mirabilis
III) Podłoża wybiórczo-różnicujące. Na tych podłożach określamy tylko kolor kolonii lub podłoża.
** Podłoże Chapmana
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
** Podłoże EMB
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Proteus mirabilis
** Podłoże McConkey a
Klebsiella pneumoniae
Escherichia coli
Proteus mirabilit
Bakterie wytwarzające endogenne barwniki  agar zwykły
Pseudomonas sp  zielone zabarwienie na zwykłym agarze. Zdolność do wytwarzania piocyjaniny i
fluoresceiny.
Micrococcus sp.  zabarwienie żółte na agarze zwykłym. Zdolność do wytwarzania sarcinoksantyny.
Serratia marcescens  wytwarza czerwony barwnik prodigiozynÄ™