Ćwiczenie 6: Metabolizm bakterii - odżywianie

W każdym podłożu musi znajdować się odpowiednie:

1. Źródło energii

2. Donory protonów i elektronów

3. Źródło węgla

Na podstawie tych 3 elementów określamy typ pokarmowy, którego nazwa składa się z 3 członów

1. Pierwszy człon nazwy pochodzi od źródła energii, czyli głównego procesu, za pomocą którego bakteria pozyskuje energię. Wyróżniamy:

• Chemotrofy - wykorzystują energię chemiczną

• Fototrofy - wykorzystują energię świetlną

2. Druga część nazwy pochodzi od rodzaju związku, którego bakteria używa jako donora elektronow i protonów (donorem jest związek utleniany przez bakterie - musi więc być zredukowany):

• Organotrofy - utleniają związki organiczne

• Litotrofy - utleniają związki nieorganiczne (cecha wyłączna dla prokariontów)

Trzecia część nazwy pochodzi od związku, którego bakterie używają jako źródła węgla:

• Autotrofy - wykorzystują CO₂

• Heterotrofy - wykorzystują związki organiczne

Przykładowym typem pokarmowym może być, np. chemoorganoheterotrof - wykorzystują energię chemiczną, źródłem węgla jest związek organiczny, który również jest wykorzystywany jako dawca protonów i elektronów; chemolitoautotrof - w ogóle nie potrzebuje związków organicznych (wyróżnia się względne oraz bezwzględne

Drugi podział organizmów ze względu na typ pokarmowy:

• Prototrofy - są zdolne do wzrostu mając jedynie dostęp do prostego związku węgla oraz soli mineralnych. Inne substancje syntetyzują właśnie z tych podstawowych związków - mając więc pełny zakres syntez. Przykład: Bacillus subtilis

• Auksotrofy - poza prostym związkiem węgla oraz solami mineralnymi wymagają substancji których nie potrafią same syntetyzować - są to tzw. czynniki wzrostowe (aminokwasy, witaminy, zasady purynowe i pirymidynowe). Przykład: Proteus vulgaris, który wymaga…

Charakterystyka podłóż:

1. Podłoże AB

Skład: 50 ml soli A (Na₂HPO₄, KH₂PO₄, pH 8,4)

50 ml soli B (NH₄Cl, MgSO₄, Na₂S₂O₃, Ph 7,0)

Roztwór czerwieni fenolowej

Sól Tuovinena (wersenian sodu, ZnSO₄, CaCl₂, MnCl₂, FeSO₄, (NH₄)₆Mo₇O₂₄, CuSO₄, CoCl₂)

Agaroid

• W tym podłożu nie ma źródła węgla -> jest to podłoże dla chemolitoautotrofów

• Dawcą elektronów jest Na₂S₂O₃ - utleniany jest do SO₄^2-

• Jest to podłoże stałe, selekcyjne dla chemolitoautotrofów utleniających tiosiarczan

• Chemolitoautotrofy mają bardzo słaby wzrost, ponieważ proces pozyskiwania energii polega na wstecznym transporcie elektronów

Dlatego dodajemy barwnik - by zobaczyć czy są bakterie (w czasie wzrostu bakterii powstaje zakwaszszenie w wyniku czego widać przebarwienie podloża)

• Chemolitoautotrofy względny wyrośnie też na agarze, bezwzględny jedynie na podłożu AB

1. Agar odżywczy

Skład: wyciąg mięsny, ekstrakt drożdżowy, pepton, NaCl, woda, agar-agar

2. Podłoże dla nitryfikatorów

Skład: woda wodociągowa, sole: (NH₄)₂SO₄, MgSO₄, FeSO₄, K₂HPO₄, NaCl, CaCO₃

3. Agar odżywczy ze skrobią (1%)

• Na tym podłożu wyrośnie wszystko ale skrobię rozłożą tylko niektóre bakterie

Więc jest to podłoże różnicujące

1. Agar odżywczy z mlekiem (4%)

• Mleko zapewnia podłożu mleczny kolor - obserwujemy które bakterie rozkładają kazeinę (białko mleka)

• Jest to więc podłoże różnicujące - wokół koloni rozkładających kazeinę widać przejaśnienie

1. Agar odżywczy z tłuszczem (3%)

• Obserwujemy czy bakterie rozkładają tłuszcze - czy pojawia się glicerol, który z miedzią daje zabarwienie

Podłoże różnicujące

1. Podłoże EMB z laktozą

Skład: ekstrakt drożdżowy, hydrolizat kazeiny, K₂HPO₄, woda, agar-agar

Roztwór eozyny

Roztwór błękitu metylenowego

20% roztwór laktozy

• Jest to podłoże bogatsze od agaru odżywczego (bo dodaliśmy jeszcze laktozy) - wszystko wyrośnie

• Wokół bakterii rozkładających laktozę powstaje zakwszaszenie, które widać, ponieważ zawarte w podłożu barwniki są wskaźnikami pH - kolonie rozkładające laktozę mają ciemniejsze, metaliczne zabarwienie (kolonie niezdolne do rozkładu laktozy są jasne)

• Podłoże różnicujące - różnicuje zdolność do rozkładania laktozy

1. Żelatyna odżywcza

Skład: żelatyna, woda, pepton

2. Podłoże Davisa dla prototrofa

Skład: sól Davisa (K₂HPO₄, KH₂PO₄, MgSO₄, (NH₄)₂SO₄, cytrynian sodu, woda)

20% roztwór glukozy

Agaroid

3. Podłoże Davisa dla auksotrofa

Skład: sól Davisa (K₂HPO₄, KH₂PO₄, MgSO₄, (NH₄)₂SO₄, cytrynian sodu, woda)

20% roztwór glukozy

Hydrolizat kazeiny

Roztwór tiaminy

Agaroid

4. Podłoże dla bakterii wiążących azot

Skład: woda,

Mannitol

K₂HPO₄, KH₂PO₄, MgSO₄, NaCl, CaCO₃, ślady MnSO₄, FeCl₂, Na₂MoO₄

• Nie ma tu żadnego źródła azotu

• Jest za to molibden potrzebny dla enzymu nitrogenazy

• Podłoże selekcyjne dla bakterii wiążących azot

• Mannitol jest źródłem węgla dla Azotobakter - wariant selekcyjny dla Azotobacter

• W warunkach beztlenowych izolujemy Clostridium - źródłem węgla jest sacharoza - wariant selekcyjny dla Clostridium

1. Podłoże Davisa z różnymi źródłami azotu

1. Skład: Bezazotowe sole Davisa

20% roztwór glukozy

10% roztwór NH₄Cl

Agaroid

2. Skład: Bezazotowe sole Davisa

20% roztwór glukozy

10% roztwór KNO₃

Agaroid

3. Skład: Bezazotowe sole Davisa

20% roztwór glukozy

20% roztwór hydrolizatu kazeiny

Agaroid

Badanie źródeł węgla i energii bakterii:

1. Określenie typu pokarmowego badanych szczepów

Na 2 podłoża (agar odżywczy i podłoże AB) wysiewamy po 4 szczepy bakterii.

Podłoże AB - podłoże bez organicznych związków węgla - zredukowanym związkiem w tym podłożu jest S₂0₃^2- - jest to podłoże dla chemolitoautotrofów dla bezbarwnych bakterii siarkowych utleniających tiosiarczan.

Jako że wzrost chemolitoautotrofów jest mało wydajny (ale sam proces utleniania jest bardzo wydajny) to o wzroście bakterii świadczy odbarwienie podłoża na skutek zakwaszenia.

Szczep	AO	AB	Typ pokarmowy
Halothiobacillus neapolitanus	-	+	Bezwzględny chemolitoautotrof
Paracoccus versutus	+	+	Względny chemolitoautotrof
Pseudomonas fluorescens	+	-	Chemoorganoheterotrof
Bacillus subtilis	+	-	Chemoorganoheterotrof

Halothiobacillus neapolitanus - jest bezwzględnym chemolitoautotrofem, ponieważ rośnie jedynie na podłożu pozbawionym organicznych związków węgla

Paracoccus versutus - jest względnym chemolitoautotrofem, ponieważ wyrósł również na podłożu zawierającym organiczny związek węgla.

Pseudomonas fluorescens i Bacillus subtilis - dla nich źródłem węgla oraz donorem protonów i elektronów jest związek organiczny

2. Wykazanie obecności bakterii nitryfikacyjnych w glebie

Bakterie nitryfikacyjne - bezwzględne tlenowce, chemolitoautotrofy utleniające związki azotowe w celu uzyskania energii

• Utlenianie związków azotowych przebiega w dwóch etapach

1. I faza - sole amonowe utleniane są do azotynów

2. II faza - azotyny utleniane są do azotanów

• Bakterie nitryfikujące występują w glebie - wzbogacają ją w związki azotowe

• Proces nitryfikacji może przebiegać jedynie w dobrze napowietrzonej glebie (ponieważ bakterie nitryfikacyjne są bezwzględnymi tlenowcami)

Do podłoża dla nitryfikatorów (sole amonowe są donorami elektronów) dodajemy grudkę gleby, do próby kontrolnej nic nie dodajemy.

Jako że bakterie nitryfikacyjne są chemolitoautotrofami to aby zaobserwować ich wzrost robimy test na obecność azotynów (czy zaszła 1 faza nitryfikacji). Do próbki hodowli oraz próby kontrolnej dodajemy odczynnik firmy Merkl - jest to roztwór α-naftyloaminy który z azotynami daje ciemnoróżowe zabarwienie.

Zabarwienie może się nie pojawić z 2 powodów:

• W hodowli nie było bakterii nitryfikacyjnych

• W hodowli było tak dużo nitryfikatorów, że wszystkie azotyny zostały utlenione do azotanów.

3. Badanie zdolności bakterii heterotroficznych do wykorzystywania różnych organicznych źródeł węgla

1. Agar odżywczy ze skrobią (1%) - badanie zdolności amylolitycznych, czyli badamy czy bakterie wydzielają amylazy.

Płytkę zalewamy płynem Lugola: skrobia z jodem daje niebieskie zabarwienie -> obszar wokół bakterii rozkładających skrobię pozostanie niezabarwiony

Szczep	Zdolności amylolityczne
Escherichia coli	-
Bacillus subtilis	+
Pseudomonas fluorescens	-
Paracoccus versutus	-

2. Agar odżywczy z mlekiem (4%) - badamy właściwości proteolityczne

Mleczny kolor podłoża jest efektem kazeiny (białka mleka). Więc jeśli bakteria rozkłada kazeinę to nastąpi odbarwienie się podłoża.

Szczep	Zdolności proteolityczne
Escherichia coli	-
Bacillus subtilis	+
Pseudomonas fluorescens	-
Paracoccus versutus	-

3. Agar odżywczy z tłuszczem (3%) - badamy właściwości lipolityczne

Badamy czy dane szczepy bakterii rozkładają tłuszcze przy udziale lipaz. Produktami rozkładu tłuszczy są kwasy tłuszczowe oraz glicerol .

Do podłoża dodajemy jonów miedzi, które kompleksją z glicerolem dając turkusowe zabarwienie.

Tak więc wokół szczepów rozkładających tłuszcze pojawi się turkusowe zabarwienie.

Szczep	Zdolności proteolityczne
Escherichia coli	-
Bacillus subtilis	-
Pseudomonas fluorescens	+

4. Podłoże EMB z laktozą -

Podłoże to służy do identyfikacji bakterii fermentujących cukry (laktozę).

Laktoza jest rozkładana przy udziale β-laktolazy. Jeśli bakterie rozkładają laktozę to powstaje zakwszaszenia na skutek którego kolonie mają ciemne, metaliczne zabarwienie.

Szczep	Zdolności proteolityczne	Kolor koloni
E. coli Lac^+	+	Ciemny wzrost
E. coli Lac^-	-	Jasny wzrost

5. Żelatyna odżywcza - badanie właściwości proteolitycznych

Żelatyna jest rozkładana przez proteazy - jeśli bakterie posiadają zdolności proteolityczne to następuje upłynnienie żelatyny

Szczep	Zdolności proteolityczne
Escherichia coli	-
Bacillus subtilis	+
Pseudomonas fluorescens	-
Paracoccus versutus	-

4. Prototrofy i auksotrofy - na odpowiednie podłoża wysiewamy różne szczepy Escherichia coli w celu sprawdzenia który szczep jest bukso- a który prototrofem.

szczep	Agar odżywczy	Podłoże Davisa (glc+NH4,SO4,PO4)	Podłoze Davisa (hydrolizat kazeiny + wit. B1 (tiamina)	Typ pokarmowy
E. coli dzika	+	+	+	Prototrof
E. coli MG1693 thy	+	-	-	Aukostrof
E. coli AB1157 thr leu pro his arg thi	+	-	+	Auksotrof

Agar odżywczy jest podłożem pełnym

E. coli MG1693 thy - szczep wymagający zasady azotowej - tyminy

E. coli AB1157 thr leu pro his arg thi - szczep wymagający aminokwasów: treoniny, leucyny, proliny, histydyny, argininy oraz tiaminy (witaminy B1)

5. Izolowanie z gleby bakterii wiążących azot cząsteczkowy

Używamy podłóż selekcyjnych - podłóż bezazotowych, aby wyizolować bakterie zdolne do wiązania azotu atmosferycznego (proces wiązania azotu zachodzi przy udziale enzymu nitrogenazy, jest to proces wymagający energii)

Przygotowujemy 2 warianty podłóż do których dodajemy grudkę gleby:

1. Podłoże bezazotowe z mannitolem (źródło węgla) w którym panują warunki tlenowe - za pomocą tego podłoża izolujemy z gleby Azotobacter.

Azotobacter jest bakterią tlenową, która wzrasta na powierzchni płynnego podłoża w postaci śluzowatego kożucha.

Nawet jeśli na tym podłożu obserwujemy takie typ wzrostu to upewniamy się robiąc preparat negatywny. Następnie obserwujemy otoczki, które wyglądają… ???

Azotobakter wytwarza również kuliste cysty, które załamują światło.

2. podłoże bezazotowe z sacharozą przechowywane w warunkach beztlenowych (wysoki słupek podłoża - aż po sam korek) -> jest to hodowla wzbogacana w kierunku selekcji Clostridium pasteurianum.

Clostridium pasteurianum jest bakterią beztlenową przeprowadzającą fermentację masłową.

Aby upewnić się czy na podłożu wyrosło Clostridium pasteurianum robimy 3 rzeczy:

• pukamy w probówkę - w przypadku Clostridium pasteurianum z dna uwalniają się pęcherzyki gazu

• sprawdzamy zapach - hodowla z Clostridium pasteurianum ma zapach zjełczałego masła

• z dna probówki pobieramy pipetą Pasteura materiał i wlewamy go do płynu Lugola - materiałem zapasowym Clostridium pasteurianum jest granuloza (analog skorbi). Tak więc w przypadku Clostridium pasteurianum powstanie barwa fioletowoczarna.

6. Wykorzystywanie różnych innych źródeł azotu - przygotowujemy 3 płytki z podłożem Davisa z trzema różnymi źródłami azotu. Na każdą płytkę siejemy 3 szczepy bakterii.

Szczep	Podłoże Davisa + NH4Cl	Podłoże Davisa + KNO3	Podłoże Davisa + hydrolizat kazeiny
Escherichia coli	+	-	+
Bacillus subtilis	+	+	+
Pseudomonas stutzeri	+	+	+

E. coli jako źródło azotu wykorzystuje sole amonowe ale nie azotany - nie jest zdolna do ich redukcji, ponieważ nie posiada reduktazy azotanowej asymilacyjnej

Reduktaza azotanowa asymilacyjna - enzym cytoplazmatyczny redukujący azotany do azotynów. Enzym ten jest hamowany przez sole amonowe

---