I

GOR

K

ONIECZNY

Zespó³ Biologii Molekularnej, Katedra Biologii Molekularnej i Komórkowej
Miêdzyuczelniany Wydzia³ Biotechnologii UG/AMG
Uniwersytet Gdañski
K³adki 24, 80-822 Gdañsk
e-mail: [e-mail]

PLAZMIDY O SZEROKIM ZAKRESIE GOSPODARZY

WSTÊP

Plazmidy s¹ pozachromosomalnymi ele-

mentami genetycznymi powszechnie wystê-
puj¹cymi w ró¿nych gatunkach bakterii. Pod-
stawowymi warunkami zapewniaj¹cymi stabil-
ne utrzymywanie siê plazmidu w komórce bak-
teryjnej s¹: zdolnoœæ replikacji DNA, kontrola
tego procesu oraz w wielu przypadkach syste-
my zapewniaj¹ce równomiern¹ segregacjê pla-
zmidów w trakcie podzia³u komórkowego.
Wiêkszoœæ plazmidów posiada zdolnoœæ do ko-
niugacji (transferu plazmidowego DNA pomiê-
dzy komórkami bakteryjnymi), co przyczynia

siê do rozprzestrzeniania ró¿norodnych cech
istotnych dla metabolizmu bakterii. Miêdzy in-
nymi plazmidy zapewniaj¹: opornoœæ na anty-
biotyki, opornoœæ na metale ciê¿kie, produkcjê
toksyn

oraz

degradacjê

szerokiej

gamy

zwi¹zków toksycznych. Ze wzglêdu na ³atwoœæ
izolacji, prostotê manipulacji genetycznych i
stosunkowo ³atw¹ analizê w warunkach labo-
ratoryjnych in vitro, systemy plazmidowe sta³y
siê modelowymi w badaniach procesu replika-
cji DNA.

PLAZMIDY O SZEROKIM ZAKRESIE GOSPODARZY

Wiêkszoœæ plazmidów posiada kolist¹, su-

perzwiniêt¹ strukturê, natomiast liniow¹ for-
mê posiadaj¹ plazmidy wyizolowane z niektó-
rych gatunków bakterii z rodzaju Streptomyces
sp. czy Borrelia sp. Uwa¿a siê, ¿e wiêkszoœæ pla-
zmidów nale¿y do grupy okreœlanej jako pla-
zmidy o w¹skim zakresie gospodarza (ang. nar-
row-host-range) i jest zdolna do replikacji DNA
oraz transferu tylko w jednym, okreœlonym ga-
tunku bakterii. W odró¿nieniu od tej grupy,
plazmidy okreœlane jako plazmidy o szerokim
zakresie gospodarzy (ang. broad-host-range)

posiadaj¹ zdolnoœæ do replikacji i stabilnego
utrzymywania siê w wielu, czêsto nie spokrew-
nionych gatunkach bakterii. DNA plazmidów o
szerokim zakresie gospodarzy mo¿e równie¿
byæ przekazywane na drodze koniugacji z ko-
mórki jednego gatunku bakterii do komórki in-
nego gatunku bakterii, staj¹c siê tym samym
czynnikiem horyzontalnego transferu genów
(T

HOMAS

i H

ELINSKI

1989, T

HOMAS

1996). Wy-

kazano, ¿e zdolnoœæ koniugacji nie jest ograni-
czona jedynie do transferu pomiêdzy komórka-
mi bakteryjnymi, ale równie¿ dotyczy transferu

Tom 51,

2002

Numer 3

(256)

Strony 273–281

Prowadzone przez nasz zespó³ badania nad molekularnymi mechanizmami zwi¹zanymi z metabolizmem DNA
plazmidów o szerokim zakresie gospodarzy, nale¿¹cymi do grupy IncP, finansowane s¹ ze œrodków Komitetu Ba-
dañ Naukowych oraz z funduszy Europejskiej Organizacji Biologii Molekularnej.

DNA z bakterii do komórek eukariotycznych
(H

EINEMANN

i S

PRAGUE

1989). Kilka dobrze ge-

netycznie scharakteryzowanych plazmidów z
grupy

niezgodnoœci

IncP1

(RK2),

IncQ

(RSF1010), IncW (pSa) i IncN (pCU1) utrzymu-
je siê stabilnie w ro¿nych gatunkach bakterii
(D

EL

S

OLAR

i wspó³aut. 1993, 1996, 1998;

H

ELINSKI

i wspó³aut. 1996). Wykazano rów-

nie¿, ¿e niektóre z naturalnie wystêpuj¹cych
plazmidów izolowanych w œrodowisku mor-
skim s¹ w stanie utrzymywaæ siê w wielu nie
spokrewnionych ze sob¹ gatunkach bakterii
(S

OBECKY

i wspó³aut. 1998)

STRUKTURA ORIGIN I MECHANIZM REPLIKACJI DNA

Do tej pory badania replikacji plazmidowe-

go DNA ograniczone by³y g³ównie do grupy
plazmidów o w¹skim zakresie gospodarzy i
bakterii Escherichia coli jako gospodarza dla
tych plazmidów. Mimo du¿ej ró¿norodnoœci
replikonów plazmidowych opisano dwa pod-
stawowe schematy inicjacji replikacji kolistego
plazmidowego DNA. Pierwszy zak³ada regula-
cjê inicjacji replikacji poprzez antysensown¹
cz¹steczkê RNA, która poprzez hybrydyzacjê
reguluje

czêstoœæ

inicjacji

(D

EL

S

OLAR

i

wspó³aut. 1998, H

ELINSKI

i wspó³aut.1996).

Przyk³ady tego typu inicjacji replikacji to pla-
zmidy z grupy ColEI oraz plazmidy RC (ang. rol-
ling circle) takie jak pT181, pUB110 czy
pMV158, których replikacja zachodzi wed³ug
modelu

s (tocz¹cego siê ko³a). Drugi mecha-

nizm inicjacji replikacji plazmidowego DNA
dotyczy plazmidów koduj¹cych w³asne bia³ka
inicjatorowe (Rep), które wi¹¿¹ siê do specy-
ficznych powtórzonych sekwencji (iteronów)
w obrêbie miejsca startu replikacji plazmido-
wego DNA (ang. origin, ori), a ich replikacja za-
chodzi wed³ug modelu

q. Do intensywnie ba-

danych plazmidów tej grupy nale¿¹ miêdzy in-
nymi P1, F, R6K, pSC101 i RK2. Zaproponowa-
no dwie strategie inicjacji replikacji plazmi-
dów o szerokim zakresie gospodarza: (i) inicja-
cja replikacji niezale¿na od bia³ek replikacyj-
nych gospodarza oraz (ii) inicjacja replikacji,
podczas której dochodzi do wspó³dzia³ania re-
plikacyjnych czynników plazmidowych z ko-
mórkowym

aparatem

replikacyjnym

(D

EL

S

OLAR

i wspó³aut. 1996).

Charakterystyczn¹ cech¹ wiêkszoœci miejsc

inicjacji replikacji replikonów (autonomicz-
nych jednostek replikacyjnych takich jak
cz¹steczki plazmidów, chromosomy, DNA wi-
rusów czy bakteriofagów) jest wystêpowanie
struktur bogatych w reszty tyminy i adeniny
(rejony A+T). W miejscach tych dochodzi do
destabilizacji dwuniciowej struktury DNA, co
rozpoczyna proces replikacji i jest warunkiem
zwi¹zania helikazy, która rozwija dwuniciow¹

matrycê DNA umo¿liwiaj¹c w ten sposób
utworzenie i propagacjê kompleksu replikacyj-
nego. Origin mo¿e równie¿ posiadaæ rejon bo-
gaty w reszty guaniny i cytozyny (rejon G+C).
Innym charakterystycznym elementem origin
replikacji s¹ wielokrotnie powtórzone se-
kwencje-iterony. Szeroka grupa plazmidów po-
siada te sekwencje, które s¹ miejscami wi¹za-
nia, kodowanego przez plazmid, bia³ka ini-
cjuj¹cego proces replikacji DNA (Rep). Wyka-
zano, ¿e iterony wystêpuj¹ w origin replikacji
plazmidów o szerokim zakresie gospodarzy na-
le¿¹cych miêdzy innymi do grup IncQ oraz
IncP (Ryc. 1). Iloœæ sekwencji powtórzonych
mo¿e wp³ywaæ na stabilnoœæ DNA plazmidu w
okreœlonych

gatunkach

bakterii

(S

CHMID-

HAUSER

i wspó³aut. 1983). Oprócz miejsc

wi¹zania plazmidowego bia³ka Rep origin
mo¿e zawieraæ jedn¹ b¹dŸ kilka sekwencji spe-
cyficznych dla wi¹zania bakteryjnego bia³ka
DnaA (sekwencje DnaA-box). Bia³ko E. coli
DnaA jest czynnikiem inicjuj¹cym replikacjê
DNA chromosomalnego, jakkolwiek wykaza-
no, ¿e mo¿e tworzyæ kompleksy w origin ró¿-
nych plazmidów. Geny koduj¹ce bia³ko DnaA
znaleziono w wiêkszoœci bakterii i wykazuj¹
one znaczny stopieñ podobieñstwa (K

AGUNI

1997, M

ESSER

i wspó³aut. 2001). Wykazano, ¿e

w przypadku plazmidów IncP sekwencje Dna-
A-box warunkuj¹ mo¿liwoœæ replikacji plazmi-
dów w niektórych gatunkach bakterii, podczas
gdy w innych gatunkach bakterii nie s¹ absolut-
nie niezbêdne w procesie inicjacji replikacji
DNA plazmidu (D

ORAN

i wspó³aut. 1999a,b).

W odró¿nieniu od plazmidów IncP, origin re-
plikacji plazmidów IncQ (RSF1010) nie zawie-
ra sekwencji DnaA-box. Inicjacja replikacji
DNA tych plazmidów nie wymaga udzia³u
bia³ek bakteryjnych, w tym bakteryjnego
bia³ka DnaA, i zachodzi jedynie przy udziale
plazmidowych bia³ek replikacyjnych wed³ug
mechanizmu typu oddzielania nici (ang. strand
displacement) (S

CHERZINGER

i wspó³aut. 1991,

1997). Plazmid RSF1010 oprócz iteronów w re-

274

I

GOR

K

ONIECZNY

jonie inicjacji replikacji, zawiera dwie palin-
dromowe sekwencje ssiA oraz ssiB, z których
niezale¿nie mo¿e zachodziæ synteza DNA. Ko-
dowane przez plazmid bia³ko RepC wi¹¿¹c siê
do sekwencji iteronów owiera strukturê origin
(powoduje miejscow¹ destabilizacjê dwuni-
ciowej helisy DNA), co pozwala na zwi¹zanie
plazmidowej helikazy RepA i w konsekwencji
rozwiniêcie helisy DNA, oddzielenie nici sta-
nowi¹cej matrycê dla syntezy. Synteza DNA
rozpoczyna siê w sposób losowy w jednych
cz¹steczkach plazmidowego DNA w miejscu

ssiA, a w innych w ssiB i powoduje powstanie
specyficznej struktury typu D-loop. W wyniku
tego procesu powstaje jedna dwuniciowa oraz
jedna jednoniciowa cz¹stka plazmidowego
DNA, która zosta³a oddzielona od matrycy. Na-
le¿y

podkreœliæ,

¿e

w

inicjacji

replikacji

RSF1010 uczestnicz¹ jedynie bia³ka kodowane
przez plazmid. Przypuszcza siê, ¿e kodowanie
przez plazmid w³asnych bia³ek replikacyjnych i
niezale¿noœæ inicjacji replikacji DNA RSF1010
od czynników bakteryjnych jest jednym z istot-
nych elementów nadaj¹cych plazmidom z gru-

Plazmidy o szerokim zakresie gospodarzy

275

Ryc. 1. Model inicjacji replikacji DNA plazmidów o szerokim zakresie gospodarzy posiadaj¹cych wie-
lokrotnie powtórzone sekwencje — iterony.

Model przedstawia mechanizmy inicjacji replikacji plazmidów nale¿¹cych do grupy IncP oraz IncQ. Podczas ini-
cjacji replikacji plazmidów IncP dochodzi do wi¹zania inicjatorowego bia³ka plazmidowego z wielokrotnie po-
wtórzonymi iteronami. Dochodzi do destabilizacji (otwarcia) dwuniciowej truktury DNA. Wi¹zanie i aktywnoœæ
bakteryjnej helikazy w rozwijaniu helisy DNA wymaga udzia³u bia³ek bakteryjnych DnaA i DnaC. Bakteryjna pri-
maza syntetyzuje startery do replikacji DNA która zachodzi jednokierunkowo na obydwu niciach (synteza nici
wiod¹cej i opó¿nionej). W wyniku jednej rundy replikacji powstaj¹ dwie dwuniciowe cz¹steczki plazmidowego
DNA. Inicjacja replikacji plazmidów IncQ nie wymaga udzia³u bia³ek bakteryjnych. Wi¹zanie plazmidowego
bia³ka inicjatorowego RepC destabilizuje strukturê DNA co pozwala na wi¹zanie plazmidowych bia³ek helikazy
RepA oraz primazy RepB w jednym z dwóch miejsc inicjacji replikacji. Helikaza oddziela jedn¹ z macierzystych
nici DNA (ang. strand displacement) co pozwala na ci¹g³¹ syntezê DNA z wykorzystaniem bakteryjnych polime-
raz DNA. W wyniku tego procesu powstaje jedna dwuniciowa oraz jedna jednoniciowa cz¹stka DNA, która na-
stêpnie s³u¿y jako matryca do syntezy nici komplementarnej.

py IncQ mo¿liwoœæ replikacji i utrzymywania
siê w wielu gatunkach bakterii.

DNA plazmidów nale¿¹cych do grupy RC

(ang. rolling circle) mo¿e zachodziæ zarówno
w bakteriach Gram-dodatnich, jak i Gram-u-
jemnych, zawiera dwa miejsca inicjacji (dso —
ang. double-strand-origin oraz sso — ang. single
strand origin) (K

HAN

2000). Inicjacja replikacji

tych plazmidów rozpoczyna siê od wi¹zania
plazmidowego bia³ka Rep w dwuniciowym
origin dso (Ryc. 2). Wi¹zanie to generuje struk-

turê g³ówki od szpilki (ang. hairpin) a nastêp-
nie naciêcie dso przez bia³ko Rep. Kolejnym
etapem jest wi¹zanie helikazy i synteza nici
wiod¹cej (z wykorzystaniem 3’OH wolego ko-
ñca powsta³ego na skutek nukleolitycznej ak-
tywnoœci Rep), w wyniku której powstaje jed-
noniciowa cz¹steczka DNA. Ten intermediat
replikacyjny zawieraj¹cy sso jest substratem
dla syntezy nici opóŸnionej z udzia³em bakte-
ryjnej polimerazy RNA (synteza starterów) i
holoenzymu DNA polimerazy III. Ostatnio za-
proponowano, ¿e specyficzne przejœcie z syn-
tezy jednoniciowego intermediatu na syntezê
plazmidowej cz¹steczki dwuniciowej mo¿e
byæ istotnym elementem nadaj¹cym plazmi-
dom RC mo¿liwoœæ replikacji w wielu gatun-
kach bakterii (K

HAN

2000).

Do grupy plazmidów IncP nale¿y plazmid

RK2 (identyczny z plazmidem RP4), który jest
du¿ym kolistym plazmidem (60kpz) wystê-
puj¹cym w szeregu bakteriach z rodziny Ente-
robacteriace, Agrobacterium sp., Azotobacter
sp., Bordetella sp., Vibrio sp., Methophilus sp.,
Pseudomonas sp., Acidobacter sp., Caulobac-
ter sp., Neisseria sp., Legionella sp., Acetobac-

ter sp., Rhizobium sp., Rhodopseudomonas
sp., Alcaligens sp., Azospirillum sp., Thiobacil-
lus sp., Xanthomonas sp. (P

ANSEGRAU

i L

ANKA

1996, T

HOMAS

i H

ELINSKI

1989). Pierwotnie zo-

sta³ zidentyfikowany jako czynnik nadaj¹cy
opornoϾ na antybiotyki patogennej bakterii
Pseudomonas aeruginosa wyizolowanej z ran
pooparzeniowych pacjentów jednego z brytyj-
skich szpitali (L

OWBURY

i wspó³aut.1969). Zi-

dentyfikowano go równie¿ jako pozachromo-
somalny element bakterii patogennych roœlin.

RK2 jest wiêc nie tylko atrakcyjny jako modelo-
wy system w badaniach podstawowych, ale
równie¿ badania nad RK2 mog¹ doprowadziæ
do uzyskania wyników o walorach aplikacyj-
nych. Ostatnie lata przynosz¹ coraz wiêcej in-
formacji dotycz¹cych molekularnych mechani-
zmów czyni¹cych plazmid RK2 zdolnym do
utrzymywania siê i propagacji w ró¿nych ga-
tunkach bakterii. W przypadku plazmidu RK2
jedynie dwa czynniki kodowane w DNA pla-
zmidowym uczestnicz¹ w inicjacji replikacji
jego DNA. S¹ to: rejon inicjacji replikacji (oriV)
oraz bia³ko inicjatorowe TrfA (F

IGURSKI

i

H

ELINSKI

1979, T

HOMAS

i wspó³aut. 1980).

Bia³ko inicjatorowe TrfA syntetyzowane jest w
dwóch formach: o d³ugoœci 44kDa (TrfA-44)
oraz 33kDa (TrfA-33). Krótka forma bia³ka
(TrfA-33) jest wystarczaj¹ca do inicjacji repli-
kacji RK2 w E. coli i szeregu innych bakterii.
Inicjacja replikacji RK2 w P. aeruginosa wyma-
ga d³u¿szej formy TrfA-44 (D

URLAND

i H

ELINSKI

1987). W obrêbie minimalnej sekwencji origin
RK2 znajduje siê piêæ miejsc wi¹zania bia³ka
TrfA: cztery miejsca wi¹zania bakteryjnego
bia³ka DnaA oraz rejon bogaty w pary A+T i re-

276

I

GOR

K

ONIECZNY

Ryc. 2. Model replikacji DNA plazmidów RC.

DNA plazmidów o szerokim zakresie gospodarzy nale¿¹cych do grupy RC (ang. rolling circle) zawieraj¹ dwa rejo-
ny inicjacji replikacji. Inicjacja replikacji DNA rozpoczyna siê poprzez wi¹zanie bia³ka inicjatorowego w rejonie
dso (ang. double strand origin), naciêcie jednej z nici DNA i syntezê nici potomnej wed³ug modelu tocz¹cego siê
ko³a. W wyniku tej syntezy powstaje jedna dwuniciowa cz¹steczka plazmidu oraz jedna jednoniciowa, której re-
plikacja zachodzi przy udziale polimeraz RNA i DNA z rejonu sso (ang. single strand origin).

jon bogaty w pary G+C (K

ONIECZNY

i wspó³aut.

1997). Minimalna sekwencja origin RK2 jest
wystarczaj¹ca do inicjacji replikacji w E. coli
oraz innych bakteriach Gram-ujemnych. Pozo-
sta³e bia³ka niezbêdne w procesie replikacji to
bia³ka bakteryjne (P

INKEY

i wspó³aut. 1988,

K

ITTELL

i H

ELINSKI

1991). Uda³o siê zrekonstru-

owaæ in vitro, z wykorzystaniem oczyszczo-
nych

enzymów,

reakcjê

replikacji

RK2

(K

ONIECZNY

i H

ELINSKI

1997a). Proces ten wy-

maga matrycy DNA zawieraj¹cej oriV, oczysz-
czonego bia³ka inicjatorowgo TrfA oraz bia³ek
E.coli: DnaA, helikazy DnaB, bia³ka DnaC, pri-
mazy DnaG, gyrazy, SSB — bia³ka wi¹¿¹cego po-
jedyncz¹ niæ DNA i holoenzymu polimerazy
DNA III. Podczas inicjacji replikacji RK2 do-
chodzi do wi¹zania bia³ka inicjatorowego TrfA
do iteronów (P

ERRI

i wspó³aut. 1991). Powsta-

je kompleks inicjacyjny. Podobnie jak inne pla-
zmidowe bia³ka inicjatorowe, TrfA wystêpuje
w postaci dimeru, jednak do DNA wi¹¿e siê
jako monomer. Wykazano, ¿e bia³ko opiekuñ-
cze E. coli ClpX aktywuje TrfA podczas inicjacji
replikacji (K

ONIECZNY

i H

ELINSKI

1997b). Akty-

wacja ta polega na monomeryzacji dimerycz-
nej formy bia³ka TrfA. Podobne wyniki otrzy-
mano dla bia³ka inicjatorowego plazmidu P1
(RepA), które jest aktywowane przez bia³ka
opiekuñcze DnaK, DnaJ, GrpE oraz ClpP
(K

ONIECZNY

i ¯

YLICZ

1999). Ostatnio stwier-

dzono, ¿e inne bia³ko ClpB (nale¿¹ce do rodzi-
ny Hsp100) wraz z bia³kami opiekuñczymi
DnaK, DnaJ i GrpE tworzy alternatywny system
aktywuj¹cy TrfA (K

ONIECZNY

i L

IBEREK

2002).

Wydaje siê, ¿e proces aktywacji nie jest ograni-
czony jedynie do bakterii E. coli i aktywacja
TrfA w innych gatunkach bakterii zachodzi z
udzia³em homologicznych lub/i analogicznych
systemów bia³ek opiekuñczych.

Bia³ko TrfA wi¹¿¹c siê z sekwencjami itero-

nów powoduje destabilizacjê podwójnej helisy
DNA w obrêbie rejonu bogatego w pary A+T
(K

ONIECZNY

i wspó³aut. 1997). W odró¿nieniu

od inicjacji replikacji w oriC, bia³ko DnaA
E. coli nie jest czynnikiem odpowiedzialnym za
powstanie kompleksu otwartego RK2, a jedy-
nie stabilizuje t¹ strukturê. Nasze badania wy-
kaza³y, ¿e równie¿ bia³ka homologiczne DnaA
wyizolowane z bakterii Pseudomonas sp. stabi-
lizuj¹ strukturê kompleksu otwartego oriV. W
odró¿nieniu, bia³ka DnaA Bacillus subtilis i
Streptomyces lividans nie stabilizuj¹ tej struk-
tury (C

ASPI

i wspólaut. 2000). Przypuszcza siê,

¿e mo¿e to byæ jeden z czynników uniemo¿li-
wiaj¹cych inicjacjê replikacji DNA RK2 w bak-

teriach Gram dodatnich. Otwarcie struktury
origin jest warunkiem zwi¹zania helikazy, któ-
ra po utworzeniu kompleksu z jedn¹ z nici
DNA rozwija dwuniciow¹ helisê DNA.

Mechanizm wi¹zania helikazy i aktywacji

kompleksu helikazy niesie wiele pytañ i to bez
wzglêdu na badany system. Praktycznie dla
¿adnego modelu badawczego, prokariotyczne-
go czy eukariotycznego, nie poznano w pe³ni
mechanizmu tworzenia kompleksu preprimo-
somu — wi¹zania helikazy do DNA (B

AKER

i

B

ELL

1998, E

GELMAN

1998). Nie wiadomo w

jaki sposób najczêœciej pierœcieniowe, heksa-
meryczne struktury helikaz replikacyjnych
wi¹¿¹ siê z DNA. Obecnie za najbardziej praw-
dopodobne uwa¿a siê otwarcie struktury pierœ-
cienia i ponowne jej zamkniêcie z jednonicio-
wym DNA znajduj¹cym siê w œrodku heksame-
ru. W ostatnich latach uda³o siê uzyskaæ pierw-
sze opisy struktury niektórych helikaz replika-
cyjnych (P

ATEL

i P

ICHA

2000). Co ciekawe, do

tej pory znajomoϾ budowy krystalicznej nie
spowodowa³a prze³omu w rozumieniu bioche-
micznego mechanizmu rozwijania podwójnej
helisy DNA. W badaniach replikacji chromoso-
mu E. coli oraz plazmidowych systemów specy-
ficznych dla tej bakterii, opisano szereg istot-
nych oddzia³ywañ bia³ek replikacyjnych z heli-
kaz¹ DnaB E. coli. Wykazano, ¿e helikaza E. coli
tworzy kompleks z bia³kiem inicjatorowym
DnaA

(M

ARSZA£EK

i

K

AGUNI

1994).

Od-

dzia³ywanie to jest istotne dla powstania kom-
pleksu preprimosomu i w konsekwencji po-
zwala na wi¹zanie helikazy z jednoniciowym
DNA w rejonie A+T w obrêbie kompleksu
otwartego oriC. Równie¿ bia³ka inicjatorowe
plazmidów, pSC101 i R6K, tworz¹ kompleksy z
helikaz¹ (R

ATNAKAR

i wspó³aut. 1996, L

U

i

wspólaut.1998, D

ATTA

i wspólaut. 1999). Od-

dzia³ywania te s¹ niezbêdne w inicjacji replika-
cji DNA tych plazmidów, jednak rola bakteryj-
nego bia³ka DnaA na tym etapie inicjacji repli-
kacji pozostaje nie wyjaœniona. Sugeruje siê, ¿e
oddzia³ywanie bia³ek DnaA-DnaB nie jest kry-
tyczne dla replikacji plazmidowego DNA
pSC101 i R6K w E. coli.

Wykazano ponadto, ¿e w odró¿nieniu od

plazmidów pSC101 i R6K, w przypadku RK2
inicjacja replikacji DNA tego plazmidu w ko-
mórkach bakteii E. coli jest zale¿na od od-
dzia³ywania DnaA-DnaB (K

ONIECZY

i H

ELINSKI

1997a). Etapem poœrednim jest kompleks heli-
kazy DnaB, zawieraj¹cy równie¿ bia³ka DnaA i
DnaC, obserwowany w rejonie sekwencji Dna-
A-box (P

ACEK

i wspó³aut. 2001). Helikaza DnaB

Plazmidy o szerokim zakresie gospodarzy

277

przy udziale TrfA ulega translokacji do rejonu
otwartego A+T. Interesuj¹ce okaza³y siê badania
z wykorzystaniem helikaz wyizolowanych z
bakterii P. putida i P. aeruginosa. W odró¿nie-
niu od helikazy E. coli bia³ka te wi¹¿¹ siê w oriV i
s¹ aktywne w rozwijaniu matrycy RK2 bez
udzia³u dodatkowego czynnika ATP-azy DnaC
(CASPI i wspó³aut. 2001). Do tej pory uwa¿ano,
¿e udzia³ bia³ek posiadaj¹cych aktywnoœæ ATP-a-
zy podczas wi¹zania replikacyjnych helikaz do
DNA jest uniwersalny i zachowany w toku ewo-

lucji. Co wiêcej, badania nasze wykaza³y, ¿e w
odró¿nieniu od helikazy E. coli, helikazy Pseu-
domonas sp. tworz¹ kompleks z d³u¿sz¹ form¹
bia³ka TrfA zwi¹zan¹ z iteronami, a utworzenie
takiego kompleksu oraz aktywnoϾ helikazy nie
wymaga udzia³u bia³ka DnaA (Ryc. 3). Wyniki te

s¹ zgodne z obserwacjami in vivo, w których
mutanty delecyjne rejonu DnaA-box oriV wyka-
zywa³y aktywnoœæ replikacyjn¹ w P. aerugino-
sa, ale nie w E. coli (D

ORAN

i wspólaut. 1999b), a

replikacja RK2 w P. aeruginosa wymaga
udzia³u d³u¿szej formy TrfA i, w odró¿nieniu od
replikacji w E. coli nie jest inicjowana przez
krótk¹ formê TrfA. Plazmid RK2, w zale¿noœci
od gatunku bakterii, wykorzystuje odmienne
mechanizmy inicjacji replikacji. Wydaje siê
wiêc, ¿e zdolnoœæ inicjacji replikacji DNA RK2

w ró¿nych gatunkach bakterii wynika z uniwer-
salnoœci struktur origin tego plazmidu i wyko-
rzystywaniu ró¿nych typów gatunkowo-specy-
ficznych oddzia³ywañ pomiêdzy dwoma forma-
mi plazmidowego bia³ka TrfA a bakteryjnymi
bia³kami replikacyjnymi.

SYSTEMY ZAPEWNIAJ¥CE RÓWNOMIERNY ROZDZIA³ CZ¥STEK PLAZMIDOWYCH ORAZ

PLAMIDOWE SYSTEMY PROGRAMOWANEJ ŒMIERCI KOMÓRKI

Inicjacja replikacji i synteza DNA nie s¹ je-

dynymi procesami zapewniaj¹cymi plazmi-

dom o szerokim zakresie gospodarzy bytowa-
nie w ró¿nych gatunkach bakterii. Jak ju¿

278

I

GOR

K

ONIECZNY

Ryc. 3. Mechanizm inicjacji replikacji plazmidu RK2 w bakteriach Escherichia coli i Pseudomonas ae-
ruginosa.

Plazmid wykorzystuje odmienne, gatunkowo specyficzne mechanizmy wi¹zania bakteryjnej helikazy. Podczas
inicjacji replikacji RK2 w E. coli niezbêdne jest oddzia³ywanie helikazy DnaB z bia³kiem DnaA. Utworzenie kom-
pleksu helikazy w origin plazmidu wymaga te¿ udzia³u bia³ka DnaC. Podczas inicjacji replikacji RK2 w P. aerugi-
nosa wi¹zanie helikazy jest DnaA i DnaC niezale¿ne. Helikaza tworzy kompleks z d³u¿sz¹ form¹ plazmidowego
bia³ka TrfA zwi¹zanego w rejonie iteronów.

wspomnia³em, jednym z procesów niezbêd-
nych do rozprzestrzeniania siê plazmidowych
cz¹steczek DNA w populacji bakterii tego sa-
mego gatunku lub pomiêdzy ró¿nymi gatunka-
mi bakterii jest proces koniugacji. Procesami
niezbêdnymi do stabilnej propagacji plazmido-
wego DNA jest rozdzia³ multimerycznych
cz¹steczek plazmidowych (ang. multimer reso-
lution systems, mrs), rozdzia³ plazmidów do
komórek potomnych (ang. partitioning) oraz
plazmidowe systemy programowanej œmierci
komórki (post segregational killing, psk).
Obecnie procesy zwi¹zane z dynamik¹ plazmi-
dowego DNA s¹ intensywnie analizowane
przez wiele grup badawczych (H

IRAGA

2000,

G

ORDON

i W

RIGHT

2000, M

OLLER

-J

ENSEN

i

wspó³aut. 2000). Okaza³o siê, ¿e cz¹steczki pla-

zmidowe zgrupowane s¹ w œciœle okreœlonych
miejscach w komórce bakteryjnej i ulegaj¹ par-
tycji w trakcie cyklu komórkowego. Molekular-
ny mechanizm tych procesów nie jest w pe³ni
poznany. Systemy psk, oparte zazwyczaj na ko-
dowanych przez plazmid toksynie i antytoksy-
nie, eliminuj¹ z populacji komórki bakteryjne,
które utraci³y plazmid zapewniaj¹c w ten spo-
sób stabilne utrzymywanie plazmidu w popu-
lacji bakterii. Nale¿y podkreœliæ, ¿e systemy
partitioning, mrs czy psk kodowane przez pla-
zmidy o szerokim zakresie gospodarza, takie
jak RK2, doskonale spe³niaj¹ swoj¹ rolê w wie-
lu gatunkach bakterii. Molekularny mecha-
nizm czy mechanizmy tych procesów nie zo-
sta³y w pe³ni poznane.

PODSUMOWANIE

Plazmidy o szerokim zakresie gospodarzy

ze wzglêdu na sw¹ specyfikê stanowi¹ bardzo
interesuj¹cy obiekt badawczy. Dopiero teraz
zaczynamy poznawaæ kompleksowoœæ tych po-
zachromosomalnych

elementów

genetycz-

nych. Co wiêcej, mo¿liwe staje siê wykorzysta-
nie zdobywanej wiedzy w biotechnologii. Pla-
zmidy o szerokim zakresie gospodarzy s¹ wy-
korzystywane jako wektory pomiêdzy komór-
kami prokariotycznymi i eukariotycznymi. Sto-
suje siê je równie¿ jako systemy ekspresji ge-
nów, w których precyzyjnie regulowana jest
iloϾ kopii matrycy DNA. Poznanie mechani-

zmów replikacji DNA w wielu gatunkach bak-
terii, oprócz aspektu czysto poznawczego,
mo¿e pozwoliæ na konstrukcjê nowych leków
antybakteryjnych. Interesuj¹ca wydaje siê mo-
¿liwoœæ wykorzystania plazmidowych syste-
mów programowanej œmierci komórki w wal-
ce z patogennymi drobnoustrojami. Plazmidy
o szerokim zakresie gospodarzy mog¹ stwo-
rzyæ mo¿liwoœci konstruowania uniwersal-
nych, specyficznych wzglêdem wielu gatun-
ków bakterii, œrodków farmakologicznych no-
wej generacji.

BROAD-HOST RANGE PLASMIDS

S u m m a r y

Broad-host-range plasmids are model systems for

exploring replication mechanisms in diverse bacterial
species and can extend our understanding of univer-
sal rules guiding DNA metabolism. Despite extensive
work carried out in many laboratories, several critical
aspects of the plasmid DNA metabolism still remain
unclear. This review is restricted to specification of
the molecular events during theta replication initia-
tion

of

the

iteron

containing

broad-host-range

plasmids. The discussion concerns RC (rolling circle)
broad-host-range plasmids replicating via sigma mode
and the well biochemically characterized initiation of
replication at Escherichia coli oriC. Recent extensive
biochemical investigations of replication initiation of
narrow-host-range plasmids: pSC101, R1, P1, F, R6K,
and broad-host- range plasmids RSF1010 and RK2 al-
low us to discuss the specificity of DNA replication ini-
tiation at broad-host- range origins.

LITERATURA

B

AKER

T. A., B

ELL

S. P., 1998. Polymerases and the repli-

some:

Machines

within

machines.

Cell

92,

295–305.

C

ASPI

R., H

ELINSKI

D. R., P

ACEK

M., K

ONIECZNY

I., 2000.

Interactions of DnaA proteins from distantly rela-
ted bacteria with the replication origin of the bro-

ad host range plasmid RK2. J. Biol. Chem. 275,
18454–18461.

C

ASPI

R., P

ACEK

M., C

ONSIGLIERI

G., H

ELINSKI

D. R.,

T

OUKDARIAN

A., K

ONIECZNY

I., 2001. A broad host

range replicone with diffrent requirements for re-
plication initiation in three bacterial species.
EMBO J. 20, 3262–3271.

Plazmidy o szerokim zakresie gospodarzy

279

D

ATTA

H. J., K

HATRI

G. S., B

ASTIA

D., 1999. Mechanism of

recruitment of DnaB helicase to the replication
origin of the plasmid pSC101. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 96, 73–78.

D

EL

S

OLAR

G., M

OSCOSO

M., E

SPINOSA

M., 1993. Rolling

circle–replicating plasmids from Gram-positive
and Gram-negative bacteria: A wall falls. Mol.
Microbiol. 8, 789–796.

D

EL

S

OLAR

G., A

LONSO

J. C., E

SPINOSA

M., D

IAZ

-O

REJAS

R.,

1996. Broad-host-range plasmid replication: An
open question. Mol. Microbiol. 21, 661–666.

D

EL

S

OLAR

G., G

IRALDO

R., R

UIZ

-E

CHEVARRIA

M. J.,

E

SPINOSA

M., D

IAZ

-O

REJAS

R., 1998. Replication and

control of circular bacterial plasmids. Microbiol.
Molec. Biol. Rev. 62, 434–464.

D

ORAN

K. S., H

ELINSKI

D. R., K

ONIECZNY

I., 1999a. A criti-

cal DnaA box directs the cooperative binding of
the Escherichia coli DnaA protein to the plasmid
RK2 replication origin. J. Biol. Chem. 274,
17918–17923.

D

ORAN

K. S., H

ELINSKI

D. R., K

ONIECZNY

I., 1999b. Ho-

st-dependent requirement for specific DnaA boxes
for plasmid RK2 replication. Mol. Microbiol. 33,
490–498.

D

URLAND

R. H., H

ELINSKI

D. R., 1987. The sequence enco-

ding the 43-kilodalton trfA protein is required for
efficient replication or maintenance of minimal
RK2 replicons in Pseudomonas aeruginosa. Pla-
smid 18, 164–9.

E

ELMAN

E. H., 1998. Bacterial Helicases. J. Struct. Biol.

124, 123–128.

F

IGURSKI

D. H., H

ELINSKI

D. R., 1979. Replication of an

origin-containing derivative of plasmid RK2 de-
pendent on a plasmid function provided in trans.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1648–52.

G

ORDON

S., W

RIGHT

A., 2000. DNA Segregation in Bac-

teria. Ann. Rev. Microbiol. 54, 681–708

H

EINEMANN

J. A., S

PRAGUE

Jr. G. F., 1989. Bacterial

conjugative plasmids mobilize DNA transfer be-
tween bacteria and yeast. Nature 340, 205–209.

H

ELINSKI

D. R., T

OUKDARIAN

A. E., N

OVICK

R. P., 1996. Re-

plication control and other stable maintenance
mechanisms of plasmids. [W:] Excherichia coli
and Salmonella, cellular and molecular biology.
N

EIDHARDT

, F. C. (red.). ASM Press, Washington, D.

C., 2, 2295–2324.

H

IRAGA

S., 2000. Dynamic Localyzation of Bacterial

and Plasmid Chromosomes. Ann. Rev. Genet. 34,
21–59.

K

AGUNI

J. M., 1997. Escherichia coli DnaA protein: the

replication initiator. Mol. Cell.

7, 145–157.

K

HAN

S. A., 2000. Plasmid rolling-circle replication: re-

cent developments. Mol. Microbiol. 37, 477–484.

K

ITTELL

B. L., H

ELINSKI

D. R., 1991. Iteron inhibition of

plasmid RK2 replication in vitro: evidence for in-
termolecular coupling of replication origins as a
mechanism for RK2 replication control. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88, 1389–93.

K

ONIECZNY

I., H

ELINSKI

D. R., 1997a. Helicase delivery

and activation by DnaA and TrfA proteins during
the initiation of replication of the broad host ran-
ge plasmid RK2. J. Biol. Chem. 272, 33312–33318.

K

ONIECZNY

I., H

ELINSKI

D. R., 1997b. The replication ini-

tiation protein of the broad-host-range plasmid

RK2 is activated by the ClpX chaperone. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 94, 14378–14382.

K

ONIECZNY

I.,

¯

YLICZ

M., 1999. Role of bacterial chape-

rones in DNA replication. Kluwer Academic/Ple-
num Publishers, New York.

K

ONIECZNY

I., L

IBEREK

K., 2002. Cooperative action of

Escherichia coli ClpB protein and DnaK chapero-
ne in the activation of a replication initiation pro-
tein. J. Biol. Chem. 277, 18483–18488.

K

ONIECZNY

I., D

ORAN

K. S., H

ELINSKI

D. R., B

LASINA

A.,

1997. Role of TrfA and DnaA proteins in origin
opening during initiation of DNA replication of
the broad host range plasmid RK2. J. Biol. Chem.
272, 20173–20178.

L

OWBURY

E. J. L., K

IDSON

A., L

ILLY

H. A., A

YLIFFEE

G. A. J.,

J

ONES

R. J., 1969. Sensitivity of Pseudomonas aeru-

ginosa to antibiotics: emergence of strains highly
resistant to carbenicillin. Lancet 448–452.

L

U

Y. -B., D

ATTA

H. J., B

ASTIA

D., 1998. Mechanistic stu-

dies of initiator-initiator interaction and replica-
tion initiation. EMBO J. 17, 5192–5200.

M

ARSZA£EK

J., K

AGUNI

J. M., 1994. DnaA Protein Directs

the Binding of DnaB Protein in Initiation of DNA
Replication in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 269,
4883–4890.

M

ESSER

W., B

LAESING

F., J

AKIMOWICZ

D., K

RAUSE

M., M

AJKA

J., N

ARDMANN

J., S

CHAPER

S., S

EITZ

H., S

PECK

C.,

W

EIGEL

C., W

EGRZYN

G., W

ELZECK

M., Z

AKRZEWSKA

-

C

ZERWINSKA

J., 2001. Bacterial replication initia-

tor DnaA. Rules for DnaA binding and roles of
DnaA in origin unwinding and helicase loading.
Biochimie 83, 5–12.

M

OLLER

-Jansen J., J

ENSEN

R. B., Gerdes K., 2000. Plasmid

and chromosome segregation in prokaryotes.
Trends Microbiol. 8, 313–320.

P

ACEK

M., K

ONOPA

G., K

ONIECZNY

I., 2001. DnaA Box

Sequences as the Site for Helicase Delivery during
Plasmid RK2 Replication in Escherichia coli. J.
Biol. Chem. 276, 23639–23644.

P

ANSEGRAU

W., L

ANKA

E., 1966. Enzymology of DNA

transfer by conjugative mechanisms. Prog. Nucle-
ic Acid. Re. Mol. Biol. 54, 197–251.

P

ANSEGRAU

W., L

ANKA

E., B

ARTH

P. T., F

IGURSKI

D. H.,

G

UINEY

D. G., H

AAS

D., H

ELINSKI

D. R., S

CHWAB

H.,

S

TANISICH

V. A., T

HOMAS

C. M., 1994. Complete nuc-

leotide sequence of Birmingham IncP-alpha pla-
smids: Compilation and comparative analysis. J.
Molec. Biol. 239, 623–663.

P

ATEL

S. S., P

ICHA

K. M., 2000. Structure and function of

hexameric helicases. Annu. Rev. Biochem. 69,
651–697.

P

ERRI

S., H

ELINSKI

D. R., T

OUKDARIAN

A., 1991. Interac-

tions of plasmid-encoded replication initiation
proteins with the origin of DNA replication in the
broad host range plasmid RK2. J. Biol. Chem. 266,
12536–43.

P

INKNEY

M., D

IAZ

R., L

ANKA

E., T

HOMAS

C. M., 1988. Re-

plication of mini RK2 plasmid in extracts of
Escherichia coli requires plasmid-encoded prote-
in TrfA and host-encoded proteins DnaA, B, G
DNA gyrase and DNA polymerase III. J. Molec.
Biol. 20

3, 927–938.

R

ATNAKAR

P. V., M

OHANTY

B. K., L

OBERT

M., B

ASTIA

D.,

1996. The replication initiator protein pi of the

280

I

GOR

K

ONIECZNY

plasmid R6K specifically interacts with the ho-
st-encoded helicase DnaB. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 93, 5522–5526.

S

CHERZINGER

E., H

ARING

V., L

URZ

R., O

TTO

S., 1991. Pla-

smid RSF1010 DNA replication in vitro promoted
by purified RSF1010 RepA, RepB and RepC prote-
ins. Nucleic Acid Res. 19, 1203–1211.

S

CHERZINGER

E., Z

IEGELIN

G., B

ARCENA

M., C

ARAZO

J. M.,

L

URZ

R., L

ANKA

E., 1997. The RepA protein of pla-

smid RSF1010 is a replicative DNA helicase. J.
Biol. Chem. 272, 30228–30236.

S

CHMIDHAUSER

T. J., F

ILUTOWICZ

M., H

ELINSKI

D. R., 1983.

Replication of derivatives of the broad host range
plasmid RK2 in two distantly related bacteria. Pla-
smid 9, 325–30.

S

OBECKY

P. A., M

INCER

T. J., C

HANG

M. C., T

OUKDARIAN

A.,

H

ELINSKI

D. R., 1998. Isolation of broad-host-range

replicons from marine sediment bacteria. App.
and Environment. Microbiol. 64, 2822–2830.

T

HOMAS

C. M., 1996. Bacterial diversity and the envi-

ronment: (Bacterial Genetics and Ecology, Naf-
plion, Greece, May 25–29, 1996). Trends in Bio-
technology 14, 327–329.

T

HOMAS

C. M., H

ELINSKI

D. R., 1989. Vegetative replica-

tion and stable inheritance of IncP plasmids. [W:]
Promiscous plsmids of gram-negative bacteria.
T

HOMAS

C. M. (red.). Academic Press, San Diego,

1–25.

T

HOMAS

C. M., M

EYER

R., H

ELINSKI

D. R., 1980. Regions of

broad-host-range plasmid RK2 which are essen-
tial for replication and maintenance. J. Bacteriol.
141, 213–22.

Plazmidy o szerokim zakresie gospodarzy

281