1

Ćwiczenie 2

BUDOWA, WŁAŚCIWOŚCI I FUNKCJA BIAŁEK

Część doświadczalna obejmuje:

- ilościowe oznaczanie białek metodą biuretową

- wytrącanie kazeiny w punkcie izoelektrycznym

- frakcjonowanie białek surowicy krwi metodą wysalania siarczanem amonu

- denaturacja białek (termiczna, etanolem o wyższym stężeniu, niektórymi kationami i anionami)

WPROWADZENIE

Łączenie się aminokwasów wiązaniami amidowymi prowadzi do utworzenia liniowej makro-

cząsteczki – polipeptydu. Łańcuchy polipeptydowe zawierające ponad 100 reszt aminokwasowych

przyjmuje się określać już jako białka. Wiązanie amidowe, nazywane również wiązaniem pep-

tydowym, powstaje z grupy

α

-karboksylowej i grupy

α

-aminowej. Na ryc. 1A przedstawiono di-

peptyd (seryloalaninę) utworzony z seryny i alaniny. Wiązanie peptydowe jest stabilizowane me-

zomerycznie, gdyż wiązanie C-N ma częściowo charakter wiązania podwójnego C=N (Ryc.

1B). To usztywnienie wiązania peptydowego powoduje, że we wszystkich ułożeniach przestrzen-

nych białek grupy amidowe pozostają płaskie. Swobodna rotacja jest możliwa tylko wokół wią-

zania N-C

α

i C

α

-C, a obroty są opisywane przez wartości kątów torsyjnych

ϕϕϕϕ

(fi) i

ψ

ψ

ψ

ψ

(psi) (Ryc.

1A).

Ryc. 1. Właściwości wiązania amidowego (peptydowego) (Koolman, Röhm 2005)

2

Ryc. 2. Struktury drugorzędowe białek (α-helisa, helisa kolagenu, pofałdowanej kartki, β-pętla)
(Koolman, Röhm 2005)

3

Konformacja łańcucha peptydowego utworzona przez kilka kolejnych reszt aminokwasowych

definiuje strukturę drugorzędową stabilizowaną wiązaniami wodorowymi (Ryc. 2).

Białka, ze względu na skład, dzieli się na białka proste i złożone. Białka proste zbudowane są

tylko z aminokwasów, natomiast białka złożone zawierają szereg różnych komponentów nieami-

nokwasowych, których rodzaj staje się podstawą podziału białek na:

- glikoproteiny - białka zawierające cukry obojętne (galaktoza, mannoza, fukoza), aminocukry

(N-acetyloglukozamina, N-acetylogalaktozamina) lub kwasy pochodne mono-

sacharydów (kwas uronowy, kwas sjalowy)

- lipoproteiny – zawierają fosfolipidy, cholesterol i inne związki lipidowe

- metaloproteiny – zawierają jony metali związane jonowo lub koordynacyjnie

- fosfoproteiny – reszty tyrozyny, treoniny lub seryny są zestryfikowane kwasem fosforowym

- nukleoproteiny – zawierają RNA lub DNA

- chromoproteiny – zawierają grupę prostetyczną, którą stanowią różne związki barwne

Na ryc. 3 pokazano potencjalne miejsca modyfikacji łańcucha polipeptydowego. Modyfika-

cjom ulegają zwykle polarne reszty aminokwasów, stanowiąc ważne źródło różnorodności białek.

Ryc. 3. Potranslacyjne modyfikacje łańcucha polipeptydowego (Koolman, Röhm 2005)

4

Białka ze względu na pełnione funkcje można podzielić na:

- enzymatyczne – najliczniejsza grupa białek (ponad 2000) o zróżnicowanej masie cząsteczkowej

- strukturalne – są odpowiedzialne za mechaniczną stabilność narządów i tkanek (kolagen, ela-

styna, tubulina, aktyna,

αααα

-keratyna). Do białek strukturalnych zalicza się tak-

że histony pełniące kluczową rolę w upakowaniu DNA w chromatynie

- transportujące – np. hemoglobina uczestniczy w transporcie tlenu i CO

2

Niektóre białka oso-

cza (prealbumina) transportujące hormony, transferyna przenosząca żelazo,

niektóre białka błonowe np. kanały jonowe pośredniczące w transporcie jonów,

nośniki w transporcie metabolitów i jonów, pompy funkcjonujące w transpor-

cie aktywnym jonów i metabolitów

- regulacyjne – białkami są niektóre hormony (somatotropina, insulina), a także receptory

uczestniczące w percepcji różnych cząsteczek sygnałowych. Białkami regulato-

rowymi są także czynniki transkrypcyjne, regulujące ekspresję genów

- odpornościowe – białka układu immunologicznego (np. immunoglobuliny) chronią organizm

przed czynnikami chorobotwórczymi i ksenobiotykami (substancjami obcymi

dla organizmu)

- motoryczne – uczestniczą w procesach związanych z ruchem (aktyna, miozyna); kinezyna

funkcjonuje w przemieszczaniu organelli w komórce

- zapasowe – owoalbumina w białku jaja stanowi źródło aminokwasów dla rozwijającego się za-

rodka; ferrytyna wiąże żelazo w wątrobie, kazeina jest białkiem zapasowym

mleka, niektóre białka budujące mięśnie mogą być wykorzystywane jako mate-

riał energetyczny; także wiele białek roślinnych pełni funkcję zapasową

Ze względu na rozpuszczalność i kształt, białka dzielą się na: globularne (kuliste) i fibrylarne

(włókienkowate, skleroproteiny).

Do białek fibrylarnych należą: α-keratyny włosów, wełny, piór, paznokci, kolageny zawarte

głównie w tkance łącznej, elastyny, fibroina jedwabiu.

Białka globularne obejmują:

-białka obojętne (albuminy, globuliny)

-kwaśne (prolaminy, gluteiny)

-zasadowe (histony, protaminy)

Na ryc. 4 przedstawiono półschematycznie, w około 1,5-milionowym powiększeniu, struktury

kilku wewnątrz- i pozakomórkowych białek.

5

Ryc. 4. Strukturalne i funkcjonalne zróżnicowanie białek (półschematyczne struktury w około 1,5
mln powiększeniu; długość kolagenu w tym powiększeniu wynosi około 30 cm) (Koolman, Röhm
2005)

6

Rozpuszczalność białek globularnych

Cząsteczki białka są amfoterami tworzącymi w roztworach wodnych koloidy. Fazę rozproszo-

ną stanowią cząsteczki białka o wymiarach 5-100 nm i masach cząsteczkowych sięgających nawet

miliona Daltonów (Da). Większość białek wykazuje duże powinowactwo do wody. Takie koloidy

nazywamy hydrofilowymi.

Białka, podobnie jak aminokwasy, posiadają ładunek, lecz w pH równym punktowi izoelek-

trycznemu (pI) są elektrycznie obojętne (Rys. 5). Różne białka mają różne wartości punktu izo-

elektrycznego. W pH powyżej i poniżej pI białka mają ładunek odpowiednio ujemny i dodatni, w

wyniku czego białko zostaje otoczone dipolami wody (hydratacja). Zjawisko to warunkuje roz-

puszczalność w wodzie tak dużych cząsteczek jak białka. Pozbawienie białek ładunku powoduje

dezintegrację otoczki wodnej i utratę rozpuszczalności. Białka różniące się wartościami punktu

izoelektrycznego w tym samym pH środowiska będą posiadały różny ładunek i różne powinowac-

two do wody, co umożliwia ich frakcjonowanie i rozdział.

Ryc. 5. Udział ładunku elektrycznego w procesach wytrącania białka w roztworze

Z powyższego wynika, że wytrącanie białka zachodzi najłatwiej w punkcie izoelektrycz-

nym. Jeśli proces ten będzie przebiegał w niskiej temperaturze (0-5

0

C), to uzyskane w osadzie

białko, po rozpuszczeniu zachowa cechy charakterystyczne dla białka natywnego.

Na ryc. 6 pokazana jest zależność rozpuszczalności białka od pH w warunkach zróżnicowa-

nego stężenia NaCl. Rozpuszczalność białka wyraźnie maleje w pH zbliżonym do pI. Największy

spadek rozpuszczalności obserwuje się w warunkach niskiego stężenia soli (1 mM NaCl).

7

Ryc. 6. Wpływ pH i niewielkich stężeń NaCl na rozpuszczalność β-laktoglobuliny w 25

0

C

(Lehninger 1979)

Wpływ stężenia soli na rozpuszczalność białek

Rozpuszczalność jest funkcją zarówno stężenia soli obojętnej, jak też ilości ładunków wszyst-

kich rodzajów jonów znajdujących się w roztworze. Wartości te określają siłę jonową roztworu: µ

= 1/2Σc

i

z

i

2

(c – stężenie jonów; z – ładunek jonów)

Ryc. 7. Zasalanie (wsalanie) i wytrącanie białek (wysalanie) w warunkach rosnącej siły jonowej

roztworu (Koolman, Röhm 2005)

8

Rozpuszczalność białka w wodzie destylowanej jest bardzo mała, natomiast rośnie wraz ze

wzrostem siły jonowej, gdyż rośnie liczba jonów nieorganicznych na powierzchni białka zapobie-

gających ich agregacji. Zjawisko to nazywa się wsalaniem lub zasalaniem (Ryc. 7). Przy odpo-

wiednio dużej sile jonowej, sól odciąga cząsteczki wody od powierzchni białek i doprowadza do

ich agregacji (wysalanie białka) (Ryc. 7). Białko(a) wysolone rozpuszcza się ponownie po usu-

nięciu soli lub po rozcieńczeniu roztworu.

Zdolność wysalająca soli zależy zarówno od charakteru kationu, jak i anionu. Ze względu na

siłę wysalającą można uszeregować kationy i aniony w następujący sposób:

Aniony: cytrynian

3-

> winian

2-

> siarczan

2-

> octan

-

> chlorek

-

> azotan

-

> rodanek

-

Kationy: Th

3+

> Al

2+

> Se

2+

> Sr

2+

> Ca

2+

> Mg

2+

> NH

4

+

> Na

+

> Li

+

Szeregi te noszą nazwę szeregów liotropowych lub szeregów Hofmeistera.

Rozpuszczalność białek jest także funkcją stałej dielektrycznej środowiska, gdyż w warun-

kach nie zmieniającego się pH i siły jonowej maleje po dodaniu rozpuszczalników o niskiej

stałej dielektrycznej takich jak: etanol, aceton, glikol etylenowy. Białka w takich warunkach

agregują, gdyż dodany rozpuszczalnik zmniejsza stopień uwodnienia grup jonowych przez

zmniejszenie ilości dipoli wodnych na powierzchni cząsteczki białka. Obniżenie stałej dielek-

trycznej roztworu przez dodanie rozpuszczalnika powoduje wzrost siły przyciągania pomiędzy

przeciwnie naładowanymi grupami.

Rozpuszczalność większości białek zwiększa się w ograniczonym zakresie (0 – 40

0

C) wraz ze

wzrostem temperatury. W temperaturze powyżej 40-50

0

C większość białek zaczyna tracić trwa-

łość i ulega denaturacji. Białka mogą także denaturować w szczególnie drastycznych warunkach tj.

skrajne pH, wysoka temperatura, promieniowanie jonizujące. Denaturacja pociąga trwałą utratę

funkcji biologicznych i wiąże się ze zmianami w strukturze drugo-, trzecio- i czwartorzędo-

wej białka.

9

WYKONANIE

Kolorymetryczne oznaczanie białek metodą biuretową

Zasada metody:

Metoda polega na oznaczaniu natężenia barwy powstałej w wyniku wytworzenia związków

kompleksowych białek z jonami miedzi (II) w środowisku zasadowym, z maksimum absorbancji

przy

λ

= 540 nm. Intensywność barwy w reakcji biuretowej jest proporcjonalna do liczby wiązań

peptydowych. Zależność ta jest wykorzystywana do ilościowego oznaczania białek. Czułość me-

tody - 0,1 mg/ml.

Nazwa reakcji pochodzi od biuretu - związku powstającego w wyniku kondensacji dwóch cząste-
czek mocznika, zawierającego w swej cząsteczce wiązania amidowe

Metoda biuretowa nie nadaje się do oznaczania białek w obecności soli amonowych, gdyż jon

amonu daje również barwne kompleksy z jonami miedzi (II). W reakcji przeszkadza także siarczan

(VI) magnezu, ponieważ wytrącający się w środowisku nierozpuszczalny wodorotlenek magnezu

maskuje właściwy odczyn.

10

Odczynniki:

- standardowy roztwór albuminy - 10 mg/ml w 0,9% NaCl

- odczynnik biuretowy: 1,5 g 5hydratu CuSO

4

i 6,0 g winianu sodu i potasu rozpuścić w 500 ml

wody dest. w kolbie miarowej na 1000 ml. Następnie małymi porcjami stale mieszając dodać 300

ml

10% NaOH i uzupełnić objętość wodą dest. do 1 l. Dodać 2g KJ. Odczynnik jest stabilny.

Wykonanie krzywej standardowej i oznaczenie stężenia białek w surowicy krwi

Do suchych probówek odmierz pipetą kolejno podane w tabeli objętości standardowego roz-

tworu albuminy, wody i odczynnika biuretowego. Każdą próbę wykonaj w dwóch powtórzeniach.

Nr próby

1

2

3

4

5

6

Stężenie albuminy (mg/próbę)

1

2

3

4

5

0

Roztwór standardowy (ml)

Woda destylowana (ml)

Odczynnik biuretowy (ml)

A

1

A

540nm

A

2

A

śr

K =

mg albuminy w próbie

A

540 nm

0,1

0,4

2,0

0,2

0,3

2,0

0,3

0,2

2,0

0,4

0,1

2,0

0,5

0

2,0

0

0,5

2,0

Równocześnie oznacz zawartość białka w 10-krotnie rozcieńczonej surowicy krwi (do oznaczeń

pobierz 0,5 i 0,1 ml; w tym drugim przypadku próbę uzupełnij wodą do 0,5 ml). Po upływie 30

min zmierz absorbancję prób przy długości fali

λ

= 540 nm w 1 cm kuwetach. Pomiaru dokonaj

względem próby zerowej nie zawierającej białka (próba 6). Zapisz wyniki w tabeli. Oblicz współ-

czynnik kierunkowy K. Narysuj krzywą wzorcową (zależność wartości absorbancji od stężenia

białka w próbie). Przy obliczaniu ilości białka w próbie stosuj obliczony współczynnik K. Z ozna-

czonej w próbie zawartości białka oblicz stężenie białka w surowicy.

11

Wytrącanie i denaturacja białek

Wytrącanie białek

Wytrącanie białek w punkcie izoelektrycznym

Do 1 ml 0,1% roztworu kazeiny, rozpuszczonej w 50 mM roztworze octanu sodu, dodawać

bardzo powoli pipetą Pasteura, cały czas delikatnie wytrząsając, około 1,5 ml 0,5 M roztworu

kwasu octowego. Obserwować pojawianie się zmętnienia pochodzącego od wytrącającego się

białka, które powinno rosnąć z upływem czasu. Po 5 min dodać porcjami jeszcze około 1,5 ml

0,5 M roztworu kwasu octowego i obserwować czy wytrącona w pI kazeina rozpuszcza się po ob-

niżeniu pH roztworu (wartość pI kazeiny wynosi 4,7)

Frakcjonowanie białek surowicy krwi metodą wysalania siarczanem amonu

Do wysalania białek stosujemy najczęściej związki o wysokim powinowactwie do wody tj.

siarczan (VI) amonu lub siarczan (VI) sodu.

Ćwiczenie wykonujemy w probówkach wirówkowych. Do 2 ml

surowicy (10-krotnie roz-

cieńczonej 0,9% roztworem NaCl) dodać 2 ml nasyconego roztworu (NH

4

)

2

SO

4

. Po zmieszaniu

roztworów uzyskuje się półnasycenie (50% nasycenie) siarczanu (VI) amonu. Agregujące globuli-

ny odwirować w wirówce stołowej, a następnie zlać klarowny supernatant do suchej probówki

wirówkowej. Do osadu globulin dodać niewielką ilość wody destylowanej do całkowitego roz-

puszczenia białek. Do przelanego supernatantu dodawać, cały czas wytrząsając, kryształki

(NH

4

)

2

SO

4

, tak by uzyskać roztwór nasycony (kryształki siarczanu amonu przestają się rozpusz-

czać). Wzrost siły jonowej roztworu powoduje wytrącanie się frakcji albumin.

Wytrącanie białek surowicy krwi etanolem

Do 0,5 ml surowicy 10x rozcieńczonej 0,9% roztworem NaCl i oziębionej w lodzie dodać 1 ml

96% etanolu. Powstaje zmętnienie, które znika po natychmiastowym rozcieńczeniu 0,9% NaCl lub

wodą.

Denaturacja białek

Termin ten dotyczy wszystkich zmian w strukturze cząsteczki białka, w wyniku których białko

traci swoje biologiczne właściwości. Denaturacja następuje wówczas, gdy pod wpływem czynni-

ków fizycznych lub chemicznych ulega zniszczeniu struktura IV-, III- lub II-rzędowa.

12

Denaturacja cieplna białek

2 ml

1% roztworu albuminy lub 1% roztworu białka jaja kurzego ogrzać do zagotowania. Two-

rzy się biały osad wytrąconego białka.

Denaturacja białek etanolem

Rozpuszczalniki organiczne (etanol, aceton, eter) i detergenty działają na strukturę przestrzen-

ną cząsteczki białka, osłabiając wiązanie hydrofobowe, reagują bezpośrednio z naładowanymi

grupami na powierzchni cząsteczki i dezorganizują płaszcz wodny cząsteczki. Działanie denatu-

rujące etanolu objawia się dopiero przy większych jego stężeniach, po dłuższym czasie dzia-

łania i w wyższej temperaturze (20

0

- 30

0

C).

Do probówki dodać 1 ml 1% albuminy i 1 ml 96% etanolu. Po godzinie rozcieńczyć zawartość

probówki wodą. Osad nie rozpuszcza się. Porównaj z ćwiczeniem, w którym białka były wytrą-

cane etanolem.

Strącanie białek za pomocą kationów

Białka w pH wyższym od pI posiadają ładunek ujemny i mogą reagować z kationami. Kationy

metali alkalicznych dają sole dobrze dysocjujące i rozpuszczalne w wodzie, natomiast kationy me-

tali ciężkich (Fe

2+

, Cu

2+

, Hg

2+

, Pb

2+

, Ag

+

) tworzą sole nierozpuszczalne.

Do 0,5 ml 1% roztworu albuminy dodać parę kropel 1% roztworu FeCl

3

. Wytrąca się osad

białczanu żelaza (III). Wykonać analogiczną próbę z HgCl

2

, Pb(CH

3

COO)

2

oraz AgNO

3

.

Strącanie białek kwasem sulfosalicylowym i trójchlorooctowym

COOH

OH

HO

3

S

C

Cl

Cl

Cl

COOH

Kwas sulfosalicylowy Kwas trójchlorooctowy

Do 0,5 ml 1% roztworu albuminy dodać 0,5 ml 10% roztworu kwasu trójchlorooctowego.

Końcowe stężenie kwasu niezbędne do odbiałczania nie powinno być niższe niż 5%.

Do 0,5 ml

1% roztworu albuminy dodać kilka kropel 20% roztworu kwasu sulfosalicylowego.

13

Zagadnienia do przygotowania:

- budowa i właściwości wiązania amidowego (peptydowego)

- struktury drugorzędowe białek (wiązania stabilizujące strukturę)

-wiązania stabilizujące III- i IV- rzędową strukturę białek

- białka proste i złożone; przykłady potranslacyjnej modyfikacji łańcuchów bocznych

aminokwasów

-podział białek ze względu na funkcję (przykłady)

- kolorymetria (zasada ilościowego oznaczania białek metodą biuretową)

-właściwości białek w roztworze (zależność rozpuszczalności białek od pH, siły jonowej, stałej

dielektrycznej rozpuszczalnika, temperatury)

-zasada wytrącania białek w pI, wytrącania przez wysalanie lub obniżenie stałej dielektrycznej

roztworu

- denaturacją białek (termiczna, wyższe stężenie etanolu, kationy metali ciężkich, niektóre kwasy

organiczne)

Piśmiennictwo:

Biochemia – JM Berg, JL Tymoczko, L Stryer PWN, Warszawa, 2005

Biochemia – AL. Lehninger PWR i L, Warszawa, 1979

Ćwiczenia z biochemii - (pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz) PWN, Warszawa, 2005

Biochemia. Ilustrowany przewodnik – J Koolman, K-H Röhm, PZWL, Warszawa 2005