LABORATORIUM BIOTECHNOLOGII PRZEMYSŁOWEJ

Kierunek:

Biotechnologia

Specjalność:

Agrobiotechnologia

Studium:

dzienne

ĆWICZENIE NR 16

PRODUKCJA IMMOBILIZOWANEGO

KATALIZATORA METODĄ PUŁAPKOWANIA I

MIKROKAPSUŁKOWANIA.

UNIWERSYTET TECHNOLOGICZNO – PRZYRODNICZY

W

YDZIAŁ

T

ECHNOLOGII I

I

NśYNIERII

C

HEMICZNEJ

Katedra Inżynierii Chemicznej i Bioprocesowej

B

YDGOSZCZ

Laboratorium biotechnologii przemysłowej.

Ć

wiczenie nr 16.

2

1. Wprowadzenie

Tradycyjnie prowadzi się procesy biosyntezy lub biotransformacji za pomocą

enzymów natywnych lub zawiesiny komórek drobnoustrojów. Tego typu rozwiązania

procesowe mają szereg wad i z tego względu immobilizowane (unieruchomione)

biokatalizatory znajdują coraz szersze zastosowanie w biotechnologii przemysłowej.

Immobiliozowane biokatalizatory otrzymuje się z materiału biologicznego w postaci całych

komórek, struktur podkomórkowych lub enzymów.

Zastosowanie biokatalizatora w postaci immobilizowanych komórek ma następujące

zalety:

•

Wysoka koncentracja komórek w jednostce objętości bioreaktora prowadzi do wzrostu

produktywności

•

Istnieje możliwość prowadzenia ciągłego procesu w kontrolowanych warunkach

•

Łatwe wydzielanie i oczyszczanie produktów

•

Mniejsze niebezpieczeństwo zakażenia przy krótkich czasach przebywania roztworu

reakcyjnego w bioreaktorze

Występują także pewne wady przy tym rozwiązaniu procesowym:

•

Utrudniony dopływ substratów i odpływ produktów na skutek oporów dyfuzyjnych

•

Zakłócenie procesów metabolicznych w przypadku użycia żywych komórek

•

Nakłady na produkcję immobilizowanego enzymu

Znanych jest wiele metod immobilizacji materiału biologicznego. Dobór odpowiedniej

metody zależy od wymogów jakie musi spełnić immobilizowany biokatalizator w danym

procesie .

Immobilizacje materiału biologicznego można uzyskać przez następujące metody:

1.

Agregację fizyczna lub chemiczną

2.

Wiązanie z nośnikiem poprzez adsorpcję lub wiązanie kowalencyjne,

3.

Pułapkowanie (inkluzję) w sieci polimerowej lub kapsułkowanie.

Agregację uznaje się za jeden z najprostszych sposobów immobilizacji. Jeżeli chodzi

o metody fizyczne to stosuje się je w praktyce tylko dla komórek mikroorganizmów, które

wykazują w określonych warunkach tendencję do tworzenia agregatów (flokuł). Agregację

chemiczna realizuje się przez działanie na materiał biologiczny substancjami zawierającymi

dwie grupy funkcyjne (aldehyd glutarowy, karbodiimidy itd.). Z reguły występują trudności

przy kontrolowaniu wielkości cząstek agregatów, a ponadto ich wytrzymałość mechaniczna

jest często niewystarczająca.

Wiązanie z nośnikiem jest metodą immobilizacji o znacznie większym, praktycznym

znaczeniu. Podstawowe wymagania w odniesieniu do materiałów jako nośników są

następujące:

- trwałość chemiczna i biologiczna,

Laboratorium biotechnologii przemysłowej.

Ć

wiczenie nr 16.

3

- odporność na ścieranie,

- duża powierzchnia właściwa,

- dogodna postać z technologicznego punktu widzenia( np. kuliste granulki maja małe

opory przepływu przez złoże,

- niska cena.

Nośniki do immobilizacji dzieli się na nieorganiczne i organiczne. Do nośników

nieorganicznych zalicza się: krzemionkę, tlenki metali (np. glinu, tytanu), szkło porowate,

materiały ceramiczne, naturalne glinokrzemiany, bentonit. Jako nośniki organiczne stosuje się

następujące materiały:

- polisacharydy (celuloza, dekstran, agaraza, chitozan itd.)

- polimery syntetyczne (poliakryloamid, poliuretany, poliamidy, itd.)

- jonowymienne żywice polimerowe (Amberlit, Duolit),

- kolagen.

Immobilizację całych komórek prowadzi się bardzo często przez inkluzję

(pułapkowanie) w polimerach. Stosowane są polimery syntetyczne (poliakryloamid,

poliuretany, poliamidy itd.) lub pochodzenia naturalnego (agar, alginiany, chitozan, karagen

itd.). W trakcie polimeryzacji polimerów syntetycznych często dochodzi do dezaktywacji

materiału biologicznego. Zaletą polimerów naturalnych są łagodne warunki podczas

immobilizacji.

Immobilizowane komórki drobnoustrojów stosuje się obecnie do prowadzenia szeregu

procesów biotechnologicznych. Taka forma biokatalizatora pozwala na wielokrotny wzrost

produktywności w porównaniu do tradycyjnych metod fermentacyjnych. Ważną zaletą

immobilizowanych biokatalizatorów jest możliwość uciąglenia procesów przez zastosowanie

bioreaktorów ze złożem stałym lub fluidalnym.

1.1. Immobilizacja metodą inkluzji

W metodzie inkluzji uzyskuje się najtrwalsze związanie materiału biologicznego

z nośnikiem. Istota tej metody polega na tym, że materiał biologiczny znajduje się

w trójwymiarowej sieci splecionych łańcuchów polimerowych. Średnica porów musi być

mniejsza od średnicy cząstek materiału biologicznego. Z drugiej strony pory muszą być na

tyle duże, aby zapewnić swobodną dyfuzję substratów i produktów. Zwykle uzyskiwane

nośniki mają strukturę o znacznej porowatości. Przykładowo porowatość żeli pochodzących

od kwasu akrylowego wynosi od 50% do 90%.

Nośniki syntetyczne uzyskuje się przez polimeryzację w bloku lub metodą emulsyjną.

W celu przeprowadzenia immobilizacji przygotowuje się mieszaninę reakcyjną, która zawiera

następujące składniki: materiał biologiczny, monomer, czynnik sieciujący (jeżeli jest to

Laboratorium biotechnologii przemysłowej.

Ć

wiczenie nr 16.

4

niezbędne) i wodny roztwór buforowy. W niektórych przypadkach wprowadza się do

mieszaniny dodatki, chroniące materiał biologiczny przed dezaktywacją. Następnie do

mieszaniny dodaje się czynniki inicjujące polimeryzację (nadsiarczany, fotoinicjatory).

Polimeryzacja trwa zwykle od kilku minut do kilku godzin i ma charakter rodnikowy.

Ze względu na wydzielające się ciepło mieszanina reakcyjna musi być chłodzona.

Spolimeryzowany żel z materiałem biologicznym rozdrabnia się mechanicznie i dlatego

otrzymywane cząstki charakteryzują się dużą niejednorodnością pod względem rozmiarów

i kształtów.

W niektórych przypadkach lepszym rozwiązaniem jest zastosowanie polimeryzacji

emulsyjnej. Podczas procesu łatwiej odprowadzać ciepło, a uzyskiwane granulki

biokatalizatora mają kształt kulisty i ich wytrzymałość mechaniczna jest kilkakrotnie większa,

niż uzyskanych przez mechaniczne rozdrobnienie spolimeryzowanego bloku. W metodzie

emulsyjnej stosuje się jednak rozpuszczalniki organiczne (toluen, chloroform), które mogą

oddziaływać negatywnie na materiał biologiczny.

Zastosowanie polimerów pochodzenia naturalnego jako nośników pozwala na

wyeliminowanie wielu wad, które występują przy otrzymywaniu nośników syntetycznych.

Podstawową zaletą polimerów naturalnych są bardzo łagodne warunki podczas immobilizacji

materiału biologicznego. Z drugiej strony takie biokatalizatory mają również pewne wady.

Najczęściej ich wytrzymałość mechaniczna jest mniejsza i może to powodować szereg

problemów przy realizacji procesu w skali przemysłowej.

1.2. Immobilizacja metodą kapsułkowania

Kapsułkowanie jest metodą polegają na otaczaniu materiału biologicznego (tzw.

rdzenia) cienką, półprzepuszczalną błoną, przez którą mogą dyfundować małocząsteczkowe

substraty i metabolity, natomiast niemożliwa jest migracja komórek. Rdzeń może stanowić od

10 % do 90 % ogólnej masy kapsułki, może być jednoskładnikowy bądź stanowić mieszaninę

w postaci stałej, ciekłej lub gazowej. Membrana może mieć budowę jedno- lub

wielowarstwową i może być wytworzona ze związków naturalnych bądź syntetycznych, np.

ż

elatyny, gumy arabskiej, tłuszczów, pochodnych celulozy, żywic, polietylenu, alginianów i

innych.

Obecnie kapsułkowanie znalazło zastosowanie w immobilizacji komórek

zwierzęcych, roślinnych, bakterii, glonów oraz grzybów. Ze względu na średnicę, kapsułki

dzieli się na: nanokapsułki (poniżej 0,2 µm), mikrokapsułki (0,2 – 5000 µm) oraz

Laboratorium biotechnologii przemysłowej.

Ć

wiczenie nr 16.

5

mikrokapsułki (powyżej 5000 µm). Kształt mikrokapsułek zależy od metody kapsułkowania,

a także od rodzaju substancji wchodzących w skład rdzenia i błony. Najczęściej wytwarza się

kapsułki idealne sferycznie, ponieważ istnienie tzw. ogonków może w przypadku ich

oderwania doprowadzić do wycieku wolnych komórek z rdzenia.

1.3. Alginiany

Alginiany należą do polisacharydów najczęściej stosowanych do immobilizacji

komórek mikroorganizmów. Kwas alginowy lub jego sole (alginiany) otrzymuje się

z brunatnych alg morskich. Alginiany są zbudowane z długich prostych łańcuchów kwasu

β

-D-mannuronowego

i

kwasu

α

-L-guluronowego,

połączonych

wiązaniami

1

→

4-glikozydowymi. W wodorostach alginiany pełnią funkcje strukturalne, podobnie jak

celuloza w roślinach i występują w postaci mieszaniny soli sodowej, wapniowej

i magnezowej. Ekstrakcja alginianów odbywa się w ten sposób, że wodorosty poddaje się

działaniu ługu sodowego, a następnie oddziela się części nierozpuszczalne poprzez filtrację.

Roztwór alginianu sodowego jest dalej oczyszczany i suszony w suszarkach rozpyłowych.

Alginiany są szeroko stosowane w przemyśle spożywczym jako czynniki zagęszczające,

stabilizujące, emulgujące i żelujące. Roztwory alginianów żelują pod wpływem jonów

dwuwartościowych (poza Mg

2+

) i trójwartościowych. Właściwości otrzymanych żeli są ściśle

skolerowane z budową i długością bloków zawierających jednostki kwasu guluronowego (G-

bloki) w łańcuchu polimerowym. Zaproponowano model “egg-box”, opisujący żelowanie

bloków kwasu guluronowego (rys.1). Wielowartościowe jony, a w szczególności jony

wapniowe, tworzą chelatujące kompleksy z blokami G zawierającymi ponad 20 jednostek

Ca

2+

Ca

2+

Ca

2+

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

Rys.1. Schemat modelu żelowania alginianów pod wpływem jonów Ca

2+

Zastosowanie alginianów ograniczone jest brakiem stabilności żelu, gdy występują

w środowisku reakcji substancje wykazujące znaczne powinowactwo wobec jonów Ca

2+

.

Laboratorium biotechnologii przemysłowej.

Ć

wiczenie nr 16.

6

2. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest

a)

zapoznanie się z metodą otrzymywania immobilizowanego biokatalizatora przez

pułapkowanie komórek drożdży w żelu alginianu wapnia

b)

zapoznanie się z metodą immobilizacji komórek drożdży w alginianie wapnia metodą

kapsułkowania

c)

wyznaczenie współczynnika efektywności otrzymanego biokatalizatora na podstawie

badań jego aktywności.

3. Część doświadczalna

pompa infuzyjna

zlewka

statyw

mieszadełko
magnetyczne

strzykawka

Rys. 2. Zestaw do produkcji granulek/kapsułek

Laboratorium biotechnologii przemysłowej.

Ć

wiczenie nr 16.

7

3.1. Produkcja biokatalizatora metodą pułapkowania

Produkowane będą granulki biokatalizatora przez pułapkowanie (inkluzję) komórek

drożdży Saccharomyces cerevisiae w żelu alginianu wapnia. Najpierw należy przygotować

roztwór alginianu sodu o stężeniu 2% mas. Następnie odmierza się 15ml wody destylowanej

do zlewki, wprowadza się 5-15g wilgotnych drożdży piekarskich (dokładną wielkość próbki

drożdży poda prowadzący ćwiczenia) i miesza w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny.

Następnie do 5g zawiesiny należy stopniowo wprowadzić około 25g roztworu alginianu i

dokładnie wymieszać. Do żelowania będzie stosowany roztwór CaCl

2

o stężeniu 1% mas. i w

ilości 50ml, który powinien być wcześniej przygotowany.

Przygotowaną zawiesinę należy pobierać strzykawką, którą następnie montuje się w

pompie infuzyjnej. Pod strzykawką umieszcza się w zlewce roztwór żelujący: CaCl

2

o

stężeniu 1% mas. i w ilości 50ml. Po uruchomieniu pompy infuzyjnej krople zawierające

alginian i komórki drożdży wpadają do roztworu w zlewce i żelują. Po zakończeniu

wkraplania należy odczekać około 15 min, aby doprowadzić do całkowitego zżelowania

granulek biokatalizatora. Po upływie tego czasu granulki należy odsączyć na sitku i po

przemyciu H

2

O

(dest)

są one gotowe do dalszych badań.

3.2. Produkcja biokatalizatora metodą kapsułkowania

Kapsułkowanie drożdży Saccharomyces cerevisiae będzie przeprowadzane metodą

jednostopniową w 1% alginianie sodu o niskiej lepkości. W tym celu należy odważyć 12g

wilgotnych drożdży piekarskich i zmieszać je z 3ml 4% CaCl

2

, który powinien być wcześniej

przygotowany. Następnie należy odmierzyć do 100ml zlewki około 50ml alginianu sodu.

Przygotowaną zawiesinę drożdży należy pobrać strzykawką zaopatrzoną w igłę o

ś

rednicy 1,2mm, którą następnie montuje się w pompie infuzyjnej. Pod strzykawką umieszcza

się na mieszadełku zlewkę z alginianem i ustawia obroty mieszadełka tak, aby powstał

niezbyt duży lej i aby krople zawiesiny trafiały na jego brzeg. Po uruchomieniu pompy

infuzyjnej krople wpadają do alginianu. W momencie zetknięcia się jonów Ca

2+

z zawiesiny z

alginianem następuje jego żelowanie na zewnętrznej warstwie kropli. W celu uformowania

kulistej kapsułki z równomierną otoczką konieczne jest zastosowanie odpowiednio

dobranych, łagodnych obrotów. Wkraplanie należy prowadzić tylko przez 2 minuty, gdyż

przy zbyt dużej ilości kropel zawiesiny w alginianie może następować ich zlepianie. Po

zakończeniu wkraplania pozostawić zlewkę jeszcze przez 6 min. na mieszadełku, odsączyć na

Laboratorium biotechnologii przemysłowej.

Ć

wiczenie nr 16.

8

sitku i kilkukrotnie przepłukać otrzymane kapsułki wodą wodociągową. Następnie Kapsułki

należy przenieść do 60ml 1% CaCl

2

i mieszać jeszcze przez 15 min. Po upływie tego czasu

kapsułki należy ponownie odsączyć na sitku i po przemyciu H

2

O

(dest)

są one gotowe do

dalszych badań.

3.3. Określanie kontrakcji objętości kropli na skutek żelowania

W celu określenia kontrakcji objętości kropli wyznacza się najpierw masę 10 kropli

roztworu, a przy obliczaniu objętości pojedynczej kropli przyjmuje się, że gęstość zawiesiny

drożdży wynosi ρ = 1050 kg/m

3

. Objętość pojedynczej granulki/kapsułki oblicza się na

podstawie pomiaru średnic 10 szt. granulek za pomocą mikroskopu. Współczynnik kontrakcji

ψ

obliczamy z zależności:

g

k

V

V

=

ψ

gdzie:

k

V

- objętość pojedynczej kropli [mm

3

],

g

V

- objętość pojedynczej granulki [mm

3

].

3.4. Wyznaczanie współczynnika efektywności biokatalizatora

Immobilizowane komórki drożdży zawierają enzym- katalazę, która katalizuje

rozkład nadtlenku wodoru na tlen i wodę. Na szybkość reakcji rozkładu nadtlenku wodoru

przez immobilizowany biokatalizator maja wpływ opory związane z dyfuzja substratu w

porach granulek bądź dyfuzji przez błonę kapsułek. W związku z tym w inżynierii

bioreaktorowej stosuje się współczynnik efektywności biokatalizatora, definiowany jako

stosunek rzeczywistej szybkości reakcji do szybkości reakcji bez oporów dyfuzyjnych.

Do pomiarów należy przygotować dwie próbki biokatalizatora wskazanego przez

prowadzącego o masach po 2g. W oznaczeniach będzie użyty wcześniej przygotowany

roztwór nadtlenku wodoru , którego stężenie należy oznaczyć metodą mangometryczną

(próbba „0”). Do zlewki zawierającej 2g biokatalizatora wlewa się 100 ml roztworu nadtlenku

wodoru o znanym stężeniu i uruchamia mieszadło magnetyczne. Po 20 min pobiera się dwie

próbki roztworu reakcyjnego i oznacza stężenie pozostałego nadtlenku wodoru przez

Laboratorium biotechnologii przemysłowej.

Ć

wiczenie nr 16.

9

miareczkowanie roztworem nadmanganianu potasu. Uzyskany rzeczywisty stopień przemiany

α

rz

obliczamy z zależności:

0

1

0

C

C

C

k

rz

−

=

α

(1)

gdzie: C

0

- początkowe stężenie H

2

O

2

, obliczone jako średnia arytmetyczna z

dwóch oznaczeń,

C

k1

- stężenie H

2

O

2

po czasie 20 min, obliczone jako średnia arytmetyczna

z dwóch oznaczeń.

Granulki drugiej próbki biokatalizatora należy mechanicznie rozetrzeć, aby w trakcie

badań aktywności nie występowały opory dyfuzji. Do zlewki zawierającej 2g roztartych

granulek należy wlać 100 ml roztworu nadtlenku wodoru o znanym stężeniu i uruchomić

mieszadło magnetyczne. Po 20 minutach pobiera się dwie próbki roztworu reakcyjnego i

oznacza się stężenie nadtlenku wodoru. Maksymalny stopień przemiany α

max

obliczamy z

zależności:

0

2

0

max

C

C

C

k

−

=

α

(2)

gdzie:

C

k 2

- stężenie H

2

O

2

po czasie 20 min rozkładu przez katalazę zawartą w

komórkach drożdży uwolnionych z granulek/kapsułek.

Współczynnik efektywności biokatalizatora η obliczamy z zależności:

max

α

α

η

rz

=

(3)

3.5. Oznaczanie stężenia H

2

O

2

metodą manganometryczną

Przy oznaczaniu stężeń nadtlenku wodoru dla każdej próbki należy przygotować

kolbki Erlenmayera z 10ml H

2

O

(dest)

i 5ml 5N kwasu siarkowego. Pobrana po odpowiednim

czasie próbka, po wprowadzeniu do tak przygotowanego roztworu zostaje zakwaszana, co

powoduje natychmiastowe zatrzymanie reakcji. Należy ją wówczas miareczkować 0,0125M

roztworem nadmanganianu potasu do uzyskania trwałej, malinowej barwy roztworu.

Nadmanganian potasowy utlenia nadtlenek wodoru zgodnie z równaniem reakcji:

2KMnO

4

+ 5H

2

O

2

+ 4 H

2

SO

4

→ 2MnSO

4

+ 5 O

2

+ 8H

2

O + 2KHSO

4

Laboratorium biotechnologii przemysłowej.

Ć

wiczenie nr 16.

10

2

2

4

3

2

5

1

1000

O

molaH

MKMnO

cm

−

−

Obliczenia należy wykonać według następującej kolejności:

a)

oblicz ile gramów KMnO

4

zużyto podczas miareczkowania próby,

b)

oblicz na podstawie w/w reakcji ile gramów H

2

O

2

odpowiada wcześnie

obliczonym gramom KMnO

4

,

c)

znając ile gramów H

2

O

2

było w badanej próbie oblicz stężenie H

2

O

2

.

4. Literatura

1.

Chmiel, Biotechnologia, Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne, PWN, Warszawa

1994.

2.

U.E. Viesturs, I.A. Szmite, A.W.śilewicz, Biotechnologia. Substancje biologicznie

czynne, technologia, aparatura, WNT, Warszawa 1992.

3.

S. Russel, Biotechnologia, PWN, Warszawa 1990.

4.

R. Dembczyński, T. Jankowski, Unieruchamianie komórek drobnoustrojów metodą

kapsułkowania – stan obecny i możliwości rozwoju tej metody. śywność. Nauka.

Technologia. Jakość 4, 2004, 5 – 17.