IMMOBILIZACJA BIOKATALIZATORÓW

Większość procesów biotechnologicznych polega na przeprowadzeniu cyklu reakcji biochemicznych, w których wyjściowy substrat jest przekształcany w produkty końcowe. Procesy takie wymagają wieloskładnikowych kompleksów enzymatycznych, które mogą być wprowadzane do reakcji w formie handlowych preparatów enzymatycznych. Najczęściej reakcje takie wymagają udziału wielu enzymów zastosowanych w ściśle określonych stężeniach i wzajemnych proporcjach, co z technologicznego punktu sterowania takim procesem jest bardzo trudne, a także kosztowne.

Dlatego też znacznie korzystniejsze jest im mobilizowanie całej komórki mikroorganizmu jako źródła enzymów. Taki proces jest dużo tańszy, gdyż pomija się etapy izolacji i oczyszczania enzymów.

Immobilizacja oznacza zatem fizyczne lub chemiczne unieruchomienie biokatalizatora poprzez związanie go z nośnikiem lub umiejscowienie w określonej przestrzeni bez użycia makroskopowego nośnika.

Systemy oparte na wykorzystaniu im mobilizowanych biokatalizatorów wykazują wiele zalet w porównaniu z systemem wolnych komórek i enzymów.

• możliwość wielokrotnego użycia i wykorzystania w procesach ciągłych

• możliwość wprowadzenia do reakcji całego kompleksu enzymatycznego jednocześnie, co ułatwia przeprowadzenie ciągów katalizowanych reakcji i polepsza wykorzystanie potrzebnych ko faktorów, które są regenerowane przez kompleks enzymatyczny

• łatwość wydzielania produktu i biokatalizatora z mieszaniny poreakcyjnej

• wyższa reaktywność, przedłużona trwałość katalityczna enzymu

• dodatni wpływ na biologiczne właściwości mikroorganizmów – komórki są wówczas mniej podatne na efekty związków hamujących, mają większą stabilność termiczną i chemiczną a powstające tą drogą produkty nie są zanieczyszczone białkami pochodzącymi z lizy komórek

• możliwość wprowadzania do reakcji dużej koncentracji komórek co przyspiesza tempo procesu

• możliwość zwiększania szybkości rozcieńczania bez obawy wymycia populacji mikroorganizmów, do którego dochodzi podczas procesów z komórkami wolnymi

• obniżone koszty procesów biotechnologicznych.

Typy immobilizowanych biokatalizatorów:

- preparaty pojedynczych enzymów katalizujących proste reakcje biochemiczne

- kompleksy 2 lub więcej enzymów (reakcje złożone)

- całe komórki bez zachowania ich funkcji życiowych

- żywe komórki z zachowaniem i wykorzystaniem ich aktywności metabolicznej.

Kryteria wyboru techniki immobilizacji żywych komórek:

- metoda immobilizacji powinna być wystarczająco łagodna, by zapewnić zdolność do regeneracji komórek

- proces powinien zapewnić regenerację złoża podczas długiego czasu działania bioreaktora

- technika immobilizacji powinna zapewnić osiągnięcie w bioreaktorze wysokiej koncentracji biomasy i utrzymywanie jej na równym poziomie przez wydłużony okres działania

- technika ta powinna być prosta i realtywnie tania

- system im mobilizowanych komórek powinien być trwały w danych warunkach pH i temperatury.

Pożądane cechy nośnika do immobilizacji komórek:

- neutralność wobec mikroorganizmu i środowiska

- odporność mechaniczna na działające w bioreaktorze:

• siły ściskania(ciśnienie hydrostatyczne)

• siły ścinające (podczas mieszania)

- odporność na atak mikrobiologiczny

- odporność na czynniki fizyczne, np. temperaturę

- odporność na czynniki chemiczne, np. kwasy, zasady, rozpuszczalniki organiczne, inhibitory, toksyny.

Metody immobilizacji

1. Wiązanie na powierzchni nośnika:

• Adsorpcja i adhezja dzięki siłom jonowym, wiązaniom wodorowym i innym oddziaływaniom fizykochemicznym. Adsorpcja do podłoża związana jest z oddziaływaniem sił Van der Waalsa i potencjału zeta (powierzchniowy ładunek elektrostatyczny wynikający z rozdziału grup COOH i NH2 na powierzchni komórki: adsorpcja następuje w wyniku odmienności ładunku komórki i nośnika. Adhezja komórek do ciał stałych związana jest z naturalną właściwością mikroorganizmów, dzięki której mogą one tworzyć filmy biologiczne; jest to zakodowana genetycznie zdolność do wytwarzania substancji klejących i cementujących (najczęściej polisacharydów). Największymi zaletami tej metody są niskie koszty używanych materiałów i łatwość wykonania. Wady: metoda mało uniwersalna, wiązanie z nośnikiem słabe i wrażliwe na zmiany warunków środowiska, np. pH, siły jonowej, temperatury. Na stopień i siłę adhezji duży wpływ ma rodzaj użytych mikroorganizmów oraz porowatość nośników. W metodach tych stosuje się nośniki organiczne, np.: węgiel, antracyt, sephadeks, drewno i in. oraz nieorganiczne: szkło, spieki szklane, cegła, ziemia okrzemkowa, materiały

ceramiczne, kaolin, tlenki metali i inne.

• Wiązania kowalencyjne takie jak peptydowe, estrowe, węgiel-węgiel, węgiel-azot i inne pomiędzy np. aktywnymi grupami ściany komórkowej a uaktywnionym nośnikiem. W wiązaniu chemicznym wykorzystuje się wiązania kowalencyjne wprowadzając do środowiska wielofunkcyjne czynniki sprzęgające (aldehydy, aminy), które znacznie ograniczają stosowanie tej metody ze względu na swoją toksyczność. Stosuje się nośniki silikonowe i ceramiczne.

2. Wiązanie w matrycy nośnika:

Metoda ta polega na otaczaniu komórek przez usieciowaną membranę lub matrycę polimerową. Jednym z podstawowych kryteriów jest dobór takiego nośnika, którego wielkość porów jest mniejsza od średnicy komórki, ale na tyle duża by substrat mógł penetrować do komórki. Jest to najpowszechniej stosowana metoda immobilizacji, zwłaszcza w przemyśle spożywczymi fermentacyjnym. System ten można realizować następującymi metodami:

• pułapkowanie w żelach naturalnych lub syntetycznych – przykłady nośników: agar, alginian, karagen, poliakrylamid, poliuretan, polistyren. Wiązanie w matrycy może następować poprzez powstawanie poprzecznych wiązań jonowych w polimerach liniowych np. alginianu w obecności kationów poliwalentnych (Ca2+, Al3+, Ba, Sr2+). Związanie biokatalizatora z nosnikiem można uzyskać poprzez wytrącanie nośnika na skutek zmian temperatury, pH lub zmianami rozpuszczalnika (żelatyna, karaginian).

• pułapkowanie na włóknach – jest odmianą żelowania przez wytrącanie, lecz stosuje się tu polimery tworzące włókna, co daje bardziej rozwiniętą powierzchnię nośnika.

3. Zamykanie wewnątrz membran półprzepuszczalnych:

• zamykanie w komórkach naturalnych, np. erytrocytach

• kapsułkowanie i mikrokapsułkowanie: kapsułki alginianowe, liposomy, kapsułki nylonowe, polimocznikowe, z pochodnych celulozy. Metoda ta polega na sporządzeniu emulsji biokatalizatora w odpowiednim medium. Taką emulsję rozpyla się w specjalnym roztworze wywołującym powstawanie otoczki wokół biokatalizatora, która selektywnie przepuszcza substraty i produkty

• zamykanie pomiędzy membranami lub w wężach półprzepuszczalnych.

4. Unieruchamianie bez makroskopowego nośnika mechanicznego:

• sieciowanie przestrzenne, kopolimeryzacja enzymów z nośnikami rozpuszczalnymi przy użyciu odczynników dwufunkcyjnych

• flokulacja komórek przy udziale – o wydajności tej metody decydują właściwości ściany komórkowej

• samoregulacja, czyli naturalna flokulacja oraz wzrost drobnoustrojów w postaci kuleczek lub kłaczków biomasy.

Przyczyny zmniejszania produktywności złoża:

1. Wymywanie enzymu lub komórek ze złoża, rozpuszczanie lub ścieranie się złoża.

2. Utrata aktywności na skutek zatruwania lub denaturacji enzymu bądź lizy komórek.

3. Pogorszenie się warunków kontaktu substratu z enzymem w wyniku zanieczyszczenia i zatkania się złoża oraz zmiany charakterystyki przepływu roztworu substratu.

4. Zakażenia mikrobiologiczne.

Zastosowanie immobilizacji:

W przemyśle farmaceutycznym:

- produkcja antybiotyków – ponad 60 % światowej produkcji kwasu 6-aminopenicylinowego (6-APA), z którego metodami chemicznymi lub enzymatycznymi otrzymuje się 16 różnych antybiotyków lak tamowych, otrzymywanych jest przy zastosowaniu im mobilizowanych biokatalizatorów;

- produkcja hormonów i witamin;

- inne leki.

Produkcja aminokwasów:

- kwas asparaginowy – transformacja Dumaranu do asparginianu poprzez komórki E. coli immobilizowane w karaginianie, produkcja: L-alaniny, kwasu L-glutaminowego, L-argininy.

W przemyśle spożywczym:

- produkcja alkoholu etylowego, octu, usuwanie laktozy z mleka, hydroliza kazeiny, skrobii, białek, produkcja witaminy B12, syropu fruktozowego, klarowanie win i soków.

W preparatyce i ochronie środowiska:

- produkcja aktywnych białek, peptydów,

- wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych,

- w ochronie środowiska (oczyszczanie ścieków).