PROCESY MEMBRANOWE W PRZEMYŚLE SPOŻYWCZYM

PROCESY MEMBRANOWE

W PRZEMYŚLE SPOśYWCZYM

OPRACOWANIE: P. KRÓLICZAK, T. JANKOWSKI

Współczesna technologia zna wiele metod oczyszczania produktów, jak np. chromatografię wielko-

składnikową, wytrącanie, krystalizację, wirowanie, destylację, sedymentację i inne. Membranowe techniki
rozdzielania mieszanin przez długi okres czasu traktowane były jako pomocnicze metody separacyjne w skali
laboratoryjnej. Ostatnie lata sprawiły, że możliwym stało się stosowanie technik membranowych na dużą skalę.
Związane to jest z rozwojem chemii tworzyw sztucznych, szczególnie polimerów syntetycznych, z których
zbudowana jest większość wysoce przepuszczalnych i selektywnych membran.

W technologii żywności stosuje się z powodzeniem takie odmiany technik membranowych, jak:

mikrofiltracja, ultrafiltracja, odwrócona osmoza, elektrodializa, nanofiltracja. Korzyści wynikające ze
stosowania wyżej wymienionych metod to przede wszystkim:

możliwość jednoczesnego zagęszczania, frakcjonowania i oczyszczania roztworów

redukcja do minimum termicznej degradacji składników żywności i mikroorganizmów

niskie zużycie energii

eliminacja przemian fazowych rozdzielanych składników (jak np. przy destylacji)

prosta, modułowa budowa urządzeń.

PODSTAWOWE POJĘCIA I PARAMETRY OPISUJĄCE TECHNIKI MEMBRANOWE

Permeat – filtrat; roztwór przenikający przez membranę filtracyjną, zawierający rozpuszczalnik wraz
z cząstkami, które nie zostały zatrzymane na filtrze.

Retentat – roztwór zawierający zatrzymane na filtrze cząstki.

Polaryzacja stężeniowa membrany – zjawisko adsorpcji drobin na powierzchni membrany, powodujące
zalepianie się por. pod wpływem adsorpcji na powierzchni membrany, powodujące zlepianie się por. pod
wpływem działającego na membranę ciśnienia, zatrzymane na niej cząstki akumulują się tworząc warstwę
ż

elową lub tzw. Wtórną membranę. Powoduje to spadek szybkości filtrowania.

Strumień objętości (flux rate)

Wyraża objętość otrzymanego permeatu na jednostkę powierzchni filtra. W początkowym etapie

filtracji, gdy filtr nie jest jeszcze zapchany, przyjmuje wartość:

∆ ∆

gdzie:

∆

P – transmembranowa różnica ciśnień

∆Π

- różnica ciśnień osmotycznych filtrowanego roztworu i permeatu

– opór hydraulityczny warstwy żelu

– opór hydraulityczny membrany.

Ponieważ ciśnienie osmotyczne dla makromolekuł w roztworze jest bardzo niskie i rośnie dopiero w przypadku
wysokiej koncentracji warstwy żelowej na membranie, to wzór ma postać:

∆

Gdy membrana ulega polaryzacji, tworzy się na niej warstwa żelu, wówczas strumień objętości wyrażamy jako:

gdzie:
K – współczynnik przenikania masy
C

– koncentracja warstwy żelu

– koncentracja filtrowanego roztworu.

Współczynnik odrzucenia R – wyraża ilość materiału, który przechodzi przez membranę lub jest przez nią
odrzucany. Gdy R ma wartość równą 1, to 100 % materiału jest odrzucane, gdy wartość ta wynosi 0, to
membrana jest całkowicie przepuszczalna. Wyraża to wzór:

gdzie:
C

– końcowa koncentracja roztworu w retentacie

– początkowa koncentracja roztworu

– początkowa objętość roztworu

– końcowa objętość retentatu.

Równanie to jest prawidłowe przy założeniu, że retentat jest całkowicie homogenny, co jest jednak warunkiem
do osiągnięcia z powodu tworzącej się na membranie warstwy żelowej. Wartość współczynnika R jest funkcją
molekularnej wielkości i kształtu rozdzielonych cząstek.

Punkt odcięcia (cut-off) – masa molekularna, przy której co najmniej 90 % cząstek globularnych o tej właśnie
masie jest na danym filtrze zatrzymywane. W wielu przypadkach punkt odcięcia jest właśnie tą wielkością, którą
producent podaje na opakowaniu, jako różnicującą poszczególne filtry.

MODYFIKACJE PROCESÓW MEMBRANOWYCH

Przeciwdziałanie zjawiskom powodującym zanieczyszczenia membran spowodowało duży postęp

w dziedzinie konfiguracji modułów membranowych, materiałów membran i optymalizacji dynamiki cieczy
w sąsiedztwie membrany. Wydajność procesów membranowych znacznie się zwiększyła po opracowaniu
systemu wykorzystującego przegrody (cross-flow). Zasadę filtracji stycznej opisuje rysunek:

Jednym z parametrów charakterystycznych dla filtracji stycznej jest ciśnienie transmembranowe, które
przyjmuje tu wartość:

∆

gdzie:
P

– ciśnienie na wejściu

– ciśnienie na wyjściu

– ciśnienie filtratu

Zaletą tego układu jest stosunkowo wolniejsze niż w typowej filtracji zapychanie się membrany, a to

dzięki temu, iż styczny ruch cieczy nieustannie zmywa tworzącą się na powierzchni filtra warstwę
zanieczyszczeń. Wydajność i efektywność procesów membranowych jest dodatkowo polepszana poprzez
niewielkie wymiary przekrojów przepływu zawiesin i roztworów. Zapewnia to burzliwy ruch cieczy i duże siły
ś

cinające na powierzchni membrany. Znane są też rozwiązania konstrukcyjne mikrofiltrów z wirującymi

powierzchniami filtrującymi, a także układy, w których zachodzi przepływ pulsacyjny lub też kierunek
przepływu zawiesiny jest co pewien czas odwracalny tak, aby zakłócić ustalony profil polaryzacji stężeniowej
i usunąć cząstki z powierzchni membrany.

RODZAJE FILTRÓW STOSOWANYCH W PROCESACH MEMBRANOWYCH

Filtry stosowane w procesach membranowych są zwykle wykonane z materiałów ceramicznych lub

syntetycznych polimerów, takich jak polisulfon, teflon czy octan celulozy. Materiały te nie są cytotoksyczne, ani
też w żaden inny sposób nie wpływają na filtrowany roztwór.

ciany

membran

filtrów

charakteryzują

się

anizotropową strukturą, tzn. kanały por rozszerzają się
od powierzchni membrany w głąb jej struktury. Dzięki
temu cząsteczki, które są zatrzymywane przez daną
membranę, zatrzymują się na jej powierzchni i nie
zapychają światła kapilar w jej wnętrzu.

Stosowane są 3 podstawowe typy filtrów:

płaskie

spiralne

kapilarne.

Filtry płaskie (flat disc) stosuje się często w konfiguracji z innymi rodzajami separatorów, np. wirowaniem

komórek.

Filtry kapilarne zbudowane są z wiązki cienkich rurek umieszczonych w cylindrycznym pojemniku. Ciecz

zawierająca oddzielane cząstki przepływa przez kapilary, gdzie ulega rozdzieleniu: cząsteczki małe przenikają
przez ściany membrany na zewnątrz do przestrzeni między-kapilarnej, zaś cząsteczki duże opuszczają kapilary.

Filtry spiralne zbudowane są z membran nawiniętych spiralnie na cylindryczny przewód odbierający filtrat.

Wybór stosowanej membrany zależy od wielu czynników, np. strumienia objętości przepływu, masy
molekularnej odcinanych cząstek, lepkości roztworu, stopnia adsorpcji białek, itp.

PODZIAŁ I CHARAKTERYSTYKA PROCESÓW MEMBRANOWYCH

Podział procesów membranowych przedstawiony poniżej opiera się na wielkości rozdzielanych w danej

metodzie cząstek za pomocą tradycyjnych metod separacji można rozdzielić cząstki o wielkości nie mniejszej
niż 2

m. Wszystkie mniejsze cząstki mogą być wydzielane z roztworów za pomocą technik membranowych.

Wielkość rozdzielanych cząstek jest podstawą przedstawionego poniżej podziału.

Mikrofiltracja (MF)

W mikrofiltracji używa się membran o porach rzędu 0,1-5

m. Za pomocą mikrofiltracji usuwa się

z roztworu drobne zawiesiny, komórki bakteryjne, niektóre wirusy, drobiny surowców roślinnych, cząstki
tłuszczu w emulsjach (np. mleka). Wizualnym efektem tego procesu może być zmiana barwy filtratu, obniżenie
się mętności, spadek intensywności rozpraszania światła. Głównym zastosowaniem mikrofiltracji jest więc
klasyfikacja roztworów, wydzielanie biomas komórkowych, a także sterylizacja pożywek (tzw. Sterylizacja „na
zimno”).

Siła napędową procesu mikrofiltracji jest różnica ciśnień hydrostatycznych po obu stronach przegrody,

rzędu 0,05-0,5 MPa. Mikrofiltrację prowadzi się często w układzie stycznym (filtracja styczna, ang. „cross-
flow”, „tangential flow”, co w większej mierze zapobiega odkładaniu się osadu na powierzchni membrany.

Ultrafiltracja (UF)

Membrany stosowane w ultrafiltracji mają pory rzędu 0,005-0,1

m (5-100 nm), a różnica ciśnień na

membranie w tym procesie wynosi 0,2-1,0 MPa.

Proces UF umożliwia jednoczesne frakcjonowanie i zagęszczanie wybranych składników cieczy.

Permeat po UF nie zawiera już białek, polisacharydów, wirusów, niektórych barwników, enzymów i witamin,
natomiast pozostają w nim proste cukry, kwasy organiczne, zdysocjowane jony nieorganiczne i większość
produktów degradacji cieplnej. Mętność ultrafiltratu całkowicie zanika i nie obserwuje się już zjawiska
rozpraszania światła.

Nanofiltracja (NF)

Nanofiltracja to proces, który obejmuje zakres separacji o wymiarach w granicach 0,001-0,005

m (1-

5 nm). Zatrzymywane są tu aminokwasy, proste cukry, enzymy i niektóre jony. Frakcja ta zawiera więc
większość substancji pochłaniających promieniowanie ultrafioletowe (cukry i produkty ich rozpadu), substancje
odpowiedzialne za smak i zapach, substancje zabarwiające. Permeat jest jasno zabarwiony, klarowny, zawiera
tylko niektóre sole i cząstki o małej masie cząsteczkowej (np. alkohole).

Sposób separacji składników w procesie NF jest połączeniem przepływu kapilarnego, typowego dla MF

i UF, z mechanizmem rozpuszczająco-dyfuzyjnym, charakterystycznym dla odwróconej osmozy (RO).
Membrany nanofiltracyjne posiadają różne zakresy selektywności, począwszy od przegród o wysokiej
nieprzepuszczalności dla NaCl, poprzez membrany wybiórczo zatrzymujące niektóre jony, do takich, które
zatrzymują cząsteczki kwasów.

Odwrócona osmoza (RO)

Proces ten przebiega na membranach o średnicy por 0,0001-0,001

m (0,1-1,0 nm). Przez taką

przegródkę przenika wyłącznie rozpuszczalnik, tak więc RO może być uważana bardziej za proces zagęszczania
niż separacji. Przepływ rozpuszczalnika następuje przeciwnie do ciśnienia osmotycznego, toteż, aby proces RO
mógł zajść musi być wytworzona duża różnica ciśnień po obu stronach membrany, rzędu 1-10 MPa. Mechanizm
selektywnego działania membran RO tłumaczy się modelem rozpuszczająco-dyfuzyjnym, gdzie znaczenie ma
powinowactwo membrany i składników roztworu oraz szybkość ich transportu w membranie. Składniki
o większym powinowactwie do materiału membrany, rozpuszczają się w niej łatwiej od innych składników,
a membrana spełnia funkcję fazy ekstrakcyjnej. W dalszym etapie procesu zachodzi transport składników
w membranie na zasadzie dyfuzji molekularnej, zaś różnice w dyfuzyjności danego składnika decydują
o przepuszczalności membrany. Selektywność membran RO jest więc połączonym efektem rozpuszczalności
i dyfuzyjności składników zagęszczonego roztworu.

Membrany stosowane w RO mają strukturę niesymetryczną, z warstewką selektywną o submikronowej

grubości, wykonaną najczęściej z octanu i innych estrów celulozy oraz z poliamidów, naniesioną na 2-gą,
grubszą warstwę podporową o większej porowatości.

Proces RO stosuje się od wielu lat na dużą skalę do otrzymywania wody pitnej z wód morskich i wód

zasolonych oraz do uzdatniania wody w przemyśle farmaceutycznym i elektronicznym.

Perwaporacja (PV)

Perwaporacja pozwala na rozdzielenie ciekłej mieszaniny z częściowym jej odparowaniem – permeat

występuje w postaci pary.
Membrany stosowane w PV mają porowatość podobną jak w RO, a transport masy zachodzi na zasadzie
mechanizmu sorpcyjno-dyfuzyjnego. Tak więc, po 1 stronie membrany następuje adsorpcja i rozpuszczanie się
składników danego roztworu; następnie rozpuszczone cząsteczki dyfundują w membranie i z jej strony ulegają
desorpcji („odparowaniu”).

Efekt rozdzielania składników roztworu wynika, podobnie jak w RO, z różnic sorpcji i rozpuszczalności

w membranie. Różnice te są natomiast efektem specyficzności oddziaływań układu membrana-ciecz lub też
wynikiem uprzywilejowanej sorpcji cząstek o mniejszym rozmiarze.

Praktyczne zastosowanie procesu perwaporacji zmierza do zastąpienia tym procesem konwencjonalnej

destylacji.

Elektrodializa (ED)

Elektrodializa to proces membranowego rozdzielania roztworów ciekłych, których składniki jonowe

(sole, kwasy, zasady) przenikają przez membrany pod wpływem różnicy potencjałów zewnętrznego pola
elektrycznego. W procesie tym membrany są jonowymienne, mają albo ładunek dodatni (przepuszczalne dla
anionów – anionity), albo ładunek ujemny (przepuszczalne dla kationów - kationity). Kationity wytwarzane są
poprzez fizyczne lub chemiczne unieruchomienie w cienkich foliach wykonanych z polimerów, grup
sulfonowych o właściwościach silnie kwaśnych lub grup karboksylowych o właściwościach słabo kwaśnych.

Anionity natomiast mają unieruchomione grupy amoniowe, silnie zasadowe lub słabo zasadowe grupy aminowe
czy też fenolowe. W ostatnich opracowano już membranę dwupolarną, umożliwiającą elektrodializę
w pojedynczej membranie.

Proces ED ma zastosowanie do odsalania morskiej oraz uzdatniania wody technologicznej, a także

do innych procesów demineralizacji.

Omówione wyżej procesy membranowe przedstawiono na schemacie, uwzględniając wymiarowe

spektrum różnych substancji występujących w ciekłych artykułach żywnościowych.

ZASTOSOWANIE PROCESÓW SEPARACJI MEMBRANOWEJ W PRZEMYŚLE SPOśYWCZYM

Procesy membranowe są w technologii żywności atrakcyjną alternatywą do tradycyjnie stosowanych

metod separacyjnych, a to ze względu na niedestrukcyjne oddziaływanie na produkt i niskie zużycie energii.

W tabeli zestawiono przykłady zastosowania procesów membranowych w różnych działaniach

towarzyszących produkcji żywności.

Zastosowanie

Produkt

Proces membranowy

„Zimna” sterylizacja

Piwo,

wino,

mleko,

moszcze,

pożywki fermentacyjne

Klarowanie

Piwo, wino, soki owocowe

MF, UF

Zagęszczanie

Białka,

soki

owocowe,

kawa,

barwniki, enzymy

UF, RO

Usuwanie alkoholu

Piwo, wino

RO, PV

Frakcjonowanie

Białka,

węglowodany,

produkty

biotechnologii

UF, RO

Odzysk produktu

Kwas mlekowy, kwas cytrynowy,
ocet, alkohol etylenowy

UF, ED, PV

Poprawa jakości produktu

Substancje smakowo-zapachowe

RO, PV

Odsalanie, demineralizacja

Woda, serwatka

RO, NF, ED

Przemysł mleczarski

Pierwsze zastosowania procesów ultrafiltracji w mleczarstwie dotyczyły utylizacji serwatki. Serwatkę
najpierw poddawano procesowi UF, w którym oddzielano frakcję białkową, a następnie RO, otrzymując
zagęszczony roztwór laktozy oraz permeat o niskim BZT. Korzyści wynikające zatem ze stosowania procesów
membranowych, w tym przypadku polegają na możliwości otrzymywania 30-80 % koncentratów białkowych
pozbawionych laktozy, zagęszczonego do ok. 25 % roztworu laktozy, a przy tym powstający ściek ma niskie
BZT.
Stosując dalej odpowiednio dobrane membrany, białka można jeszcze rozdzielić na

-laktoalbuminę i

laktoglobulinę, laktoferynę, laktoperoksydazę i glikomakropeptyd.

Frakcjonowanie białek serwatkowych w procesie UF

W serowarstwie powszechną praktyką jest wstępne zagęszczanie mleka przy użyciu UF, poprzedzające
koagulację. Poprzez to wartość odżywcza sera jest wyższa dzięki wzbogaceniu go w białka, witaminy i niektóre
substancje mineralne, tracone w serwatce w tradycyjnym procesie.
Ważną zaletą technik membranowych jest możliwość „zimnej” sterylizacji. Mleko poddawane
procesowi MF jest nikrobiologicznie czyste i nie jest wówczas wymagana typowa pasteryzacja. Pojawiają się
jednak doniesienia mówiące o tym, że przy stosowaniu membran, które pozwalają na zachowanie przez mleko
wszystkich jego białkowych składników, w permeacie zostaje część drobnoustrojów.

Przemysł owocowo-warzywny

W przemyśle tym procesy membranowe stosuje się do klarowania i zagęszczania soków, moszczów

oraz wina, do wydzielania substancji aromatycznych z ekstraktów owocowych, do zagęszczania barwników
roślinnych oraz do usuwania alkoholu z wina.

Dzięki technologiom membranowym można wyeliminować tak uciążliwe procesy jak filtracja przy

użyciu ziemi okrzemkowej, bentonitu, zolu krzemionkowego i żelatyny. Jednocześnie, stosując instalacje
membranowe, mniejsza jest powierzchnia produkcyjna, mniejsze jest zużycie energii czy też preparatów
enzymatycznych.

Połączone systemy UF i RO stosowane do odzyskiwania substancji aromatycznych zawartych

w skórkach owoców cytrusowych, w dużej mierze wpływają na lepszą jakość produktu i wydajność procesu.
Ultrafiltrację stosuje się też do pozyskiwania i zagęszczania naturalnych barwników tj. antocyjany i betanina.
Zawartość tych składników w roztworach wodnych jest bardzo niska (ok. 0,1 %), a w przewadze występują
pektyny, białka i cukry. W tradycyjnym procesie sok lub ekstrakt jest filtrowany, zagęszczany na wyparkach i
suszony rozpyłowo. Natomiast już jednokrotna UF pozwala 2-krotnie zwiększyć zawartość barwników a suchej
masie.

W produkcji winiarskiej zastosowanie MF i UF moszczów lub gotowego wina zapewnia z jednej strony

usunięcie niepożądanej mikroflory, zaś z 2 pozbawienie wina związków powodujących jego mętność. W ten
sposób eliminuje się z procesu produkcyjnego uciążliwe etapy filtracji z użyciem środków klarujących oraz
siarkowanie, jako czynnik niszczący mikroflorę. Z kolei użycie membran RO umożliwia częściowe lub
całkowite usunięcie alkoholu z wina lub też jego zagęszczenie. Otrzymuje się produkt o bardziej intensywnej
barwie i zwiększonej zawartości alkoholu.

Biotechnologia

Biotechnologia, jako szeroka dziedzina, stwarza też bardzo szerokie możliwości stosowania technik

membranowych. Począwszy od „zimnej” sterylizacji pożywek przy użyciu MF, moduły membranowe są
zastosowane w reaktorach z recyrkulacją komórek i ciągłym odbieraniem produktów oraz do separacji
i zagęszczania produktów fermentacji.
Na rysunku przedstawiono schemat tradycyjnego bioreaktora z dołączonym modułem membranowym
i możliwością recyrkulacji komórek.

Fermentor z recyrkulacją komórek.

Taki układ umożliwia ciągłość pracy fermentatora,
gdyż produkty procesu są w kontrolowany sposób
odprowadzane i ich wzrastająca koncentracja nie
inhibuje przebiegu prowadzonej reakcji. Dodatkowo
też następuje ciągłe zawracanie komórek do reaktora,
co zwiększa ich stężenie i powoduje tym samym
wzrost wydajności procesu.
Według podanego obok schematu przeprowadza się
produkcję etanolu z surowców skrobiowych i serwatki,
a także kwasu mlekowego, octowego i propionowego.
Selektywne przegrody o różnych konfiguracjach,

Z unieruchomionymi komórkami lub enzymami, służą do budowy fermentorów nazywanych reaktorami
membranowymi. Reaktory takie mogą być stosowane do prowadzenia fermentacji alkoholowej, mlekowej,
octowej oraz do enzymatycznej hydrolizy sacharozy. W fermentacji alkoholowej aplikacją zyskuje proces
perwaporacji. Etanol odprowadzany w ten sposób z cieczy fermentacyjnej ma stężenie ok. 40 %, a koszt
produkcji jest o 29 % niższy od produkowanego tradycyjnie.

Fermentacja alkoholowa z ciągłym usuwaniem etanolu za pomocą perwaporacji i recyrkulacją komórek.

Przy użyciu PV można też odprowadzać z cieczy
fermentacyjnej substancje zapachowe.
Opracowana w ostatnich latach membrana 2-polarna,
stosowana w elektrodializie, pozwala na otrzymywanie
kwasu mlekowego bez konieczności jego oczyszczania,
co jest wymagane w tradycyjnych metodach.

Inne zastosowania procesów membranowych.

Techniki membranowe, przede wszystkim UF, stosuje się do zagęszczania białka jaja kurzego. Proces

ten stosuje się też do odsalania białka jaja. Pozyskane w ten sposób czyste białko nie różni się wskaźnikami
jakościowymi od białka negatywnego.

UF stosuje się też w produkcji koncentratów białkowych z roślin oleistych. Dzięki technice

membranowej, można usunąć z ekstraktu białkowego niepożądane niskocząsteczkowe składniki (przede
wszystkim fenole), odpowiedzialne za nieprzyjemny zapach.

Przemysł spożywczy stosuje też w niektórych przypadkach techniki membranowe na rzecz OŚ. Znane

są przykłady poddawania procesowi MF solanek peklujących, w celu ich wielokrotnego użycia, a także
przykłady membranowego oczyszczania wód odpadowych.

Tlenowe hodowle mikroorganizmów na przykładzie tlenowej hodowli drożdży

Celem ćwiczenia jest:

•

zapoznanie się z przebiegiem tlenowej hodowli drożdży

•

ocena wykorzystania składników pożywki podczas hodowli drożdży

•

obliczanie bilansu masowego hodowli

WARUNKI HODOWLI DROśDśY

Do osiągnięcia właściwego przyrostu biomasy w odpowiednim czasie konieczna jest obecność

podstawowych składników pożywki we właściwych proporcjach. Niezbędne są: woda, źródła węgla i azotu,
magnezu, mikroelementów, witamin i innych substancji wzrostowych. Drożdże najlepiej rozwijają się na
pożywkach zawierających cukry proste. Podstawowymi monosacharydami wykorzystywanymi przez drożdże są
D-glukoza, D-fruktoza, D-mannoza. Disacharydem powszechnie metabolizowanym w warunkach tlenowych
i beztlenowych jest sacharoza. Niektóre gatunki drożdży mają zdolność wykorzystywania laktozy, rafinozy,
L-sorbozy, D-ksylozy, L-arabinozy czy celobiozy. Źródłem węgla mogą być także: skrobia rozpuszczalna,
pektyna, etanol, metanol, etanodiol, glicerol, niektóre kwasy organiczne i in. Do prawidłowego wzrostu
wymagają obecności substancji stymulujących m.in.: biotyny, kwasu pantenowego, mezoinozytu. Bazę podłoża
do hodowli drożdży stanowi melasa buraczana lub trzcinowa oraz brzeczka słodowa. Optymalne pH pożywki
wynosi 4-5, zawartość wody 30 % min.

Większość gatunków drożdży najszybciej rozmnaża się w temperaturach 25-32

C, chociaż występują

gatunki, dla których optymalna temperatura wzrostu wynosi 37 (gat. termofilne) lub 20

C (gat. psychrofilne).

Najniższa temperatura, w której zaobserwowano rozmnażanie się drożdży wynosi 2

C a najniższa 46

i wartości te przyjmuje się, jako punkty krytyczne.

Charakterystyka wzrostu mikroorganizmów

Wzrost mikroorganizmów można przedstawić na wykresie zależności logarytmu liczby komórek do

czasu hodowli. Powstanie krzywa wzrostu, na której można wyróżnić 6 podstawowych faz wzrostu: faza
wzrostu utajonego, faza początku rozmnażania, faza logarytmiczna (wykładnicza), faza wzrostu zwolnionego,
faza stacjonarna i faza zamierania.

Faza wzrostu utajonego – okres adaptacji komórek do nowego środowiska. Następuje w niej

energetyczna adaptacja do środowiska i uruchomienie mechanizmów umożliwiających transportowanie
składników pożywki do wnętrza komórek. Następują syntezy enzymów, białek budujących odpowiednie kanały
transportowe itp. Istnieje zasada oszczędności energetycznej, tzn., że komórka adaptuje swój metabolizm do
asymilacji najłatwiej dostępnego źródła węgla. Ilość komórek nie zmienia się tzn. x = x

= const.

Efektywność procesów tlenowych zależy od:

szybkości mieszanie pożywki

ilość doprowadzenia gazu

temperatura hodowli

stężenie substancji rozpuszczalnych

obecność substancji zmniejsza lub zwiększa napięcie powierzchniowe.

Faza początku rozmnażania się komórek (x

) – opanowanie środowiska jest tym szybsze im

większe było inokulum komórkowe. Ilość i szybkość podziałów zależy od warunków hodowli (pH, temperatury,
potencjału red-ox, siły jonowej i koncentracji O

). W sprzyjających warunkach hodowla przechodzi do fazy

3 faza wzrostu utajonego i faza początku rozmnażania są czasami ujmowane w 1 fazę, tzw. lagfazę.

Faza logarytmiczna (wykładnicza) – charakteryzuje się stałym minimalnym czasem generacji a tym

samym maksymalną szybkością wzrostu mikroorganicznego. Często wielkość komórek i zawartość w nich
białek w tej fazie jest stała, co umożliwia stosowanie pośrednich metod pomiaru biomasy. O takiej hodowli
mówi się, że zawiera ona „komórki standardowe”.

· 2

gdzie:
x

– końcowa masa komórek

n – ilość podziałów

W tej fazie szybkość wzrostu populacji (

) jest stała i jest funkcją logarytmiczną:

#$ ·

t - czas

Faza logarytmiczna trwa tak długo, dopóki nie nastąpi wyczerpanie jakiegoś składnika pożywki lub dopóki nie
wzrośnie stężenie toksycznych metabolitów do wartości krytycznej (do pojawienia się czynnika limitującego
wzrost). Określa to zależność Monoda:

gdzie:

max

– maksymalna właściwa szybkość wzrostu

– stała półnasycenia (stała hamowania), czyli stężenie substratu, przy którym:

0,5 ·

S – stężenie substratu ograniczającego:

gdzie:

max

– maksymalna właściwa szybkość wzrostu

– stężenie produktu toksycznego, przy którym

= 0,5

⋅

max

P - stężenie produktu toksycznego.

W momencie pojawienia się czynnika ograniczającego następuje zmniejszenie

i przejście do fazy wzrostu

zwolnionego.

Faza wzrostu zwolnionego (właściwa szybkość wzrostu maleje aż do momentu, kiedy ilość komórek

jest stała) i faza stacjonarna – rozpoczyna się w momencie, gdy komórki nie mogą się już rozmnażać.
Ponieważ szybkość wzrostu zależy m.in. od stężenia substratów, (które maleje podczas hodowli), szybkość
wzrostu hodowli zaczyna się zmniejszać jeszcze przed całkowitym wyczerpaniem substratu. Dlatego przejście
od fazy logarytmicznej do stacjonarnej jest zazwyczaj stopniowe. Poza ograniczeniem ilości substratu. Także
inne czynniki, tj. duża gęstość populacji, niskie ciśnienie parcjalne tlenu czy nagromadzenie toksycznych
produktów metabolizmu (np. etanol dla drożdży), mogą prowadzić do spowolnienia szybkości wzrostu
i zainicjowania fazy stacjonarnej.

W wielu produkcyjnych procesach biotechnologicznych nastawionych na wytwarzanie wtórnych

metabolitów (np. produkcja penicyliny) faza stacjonarna jest główną fazą produkcyjną. Dlatego w biotechnologii
rozróżnia się trofofazę, czyli fazę wzrostu i idiofazę – fazę produkcji. Mimo, że w idiofazie komórki już nie
rosną, potrafią one wykorzystywać podawany substrat oraz włączać związki prekursorowe do produktu
końcowego.

Faza zamierania – po pewnym czasie hodowli komórki zaczynają zamierać. Często przyczyną jest

nagromadzenie w pożywce hodowlanej toksycznych metabolitów. W niektórych wypadkach następuje liza
(autoliza) komórek wskutek działania wydzielanych przez mikroorganizmy do podłoża enzymów.

PARAMETRY CHARAKTERYZUJĄCE WZROST KOMÓREK

*właściwa szybkość wzrostu:

– końcowe stężenie komórek

– początkowe stężenie komórek

*czas generacji:

-.8

347

Dla bakterii czas generacji wynosi ok. 30 min., dla drożdży 2-3 h

*czas podziałów komórkowych:

TLENOWA HODOWLA DROśDśY

Bardzo ważny jest odpowiedni poziom natleniania i stężenia cukru w pożywce. Ludwik Pasteur

wykazał, że w obecności tlenu wydajność biomasy ze zużytej glukozy jest znacznie wyższa oraz, że tlen silnie
hamuje fermentację alkoholową. Dotyczy to mikroorganizmów, które mogą rozwijać się zarówno w warunkach
tlenowych jak i beztlenowych (np. E. coli, S. cerevisiae). Od nazwiska odkrywcy zjawisko to nosi nazwę efektu
Pasteura. Jego mechanizm polega na represji i hamowaniu enzymów szlaku EMP (Embden-Meyrhofa-Parnasa)
w obecności tlenu. W warunkach tlenowych następuje represja, a w warunkach beztlenowych indukcja, m.in.
fosfofruktokinazy, aldolazy i kinazy pirogronianowej. Przy mniejszej podaży tlenu zachodzi fermentacja
etanolowa.

W tlenowych hodowlach drobnoustrojów obserwuje się także częściowe hamowanie oddychania

komórek w warunkach stężenia glukozy ponad 1-2 [g/dm

]. Jest to tzw. Efekt Crabtree. Wysokie stężenie

glukozy wzmaga glikolizę, przy równoczesnym ograniczeniu szlaków metabolicznych związanych
z oddychaniem tlenowym (np. cykl Krebsa czy cykl pentozofosforanowy – PP), zwłaszcza podczas hodowli
drobnoustrojów w podłożu kompleksowym. Represji i hamowaniu mogą podlegać u różnych drobnoustrojów
m.in. dehydrogenaza NADH i elementy pierwszej fosforylacji w łańcuchu oddechowym oraz dehydrogenazy
funkcjonujące w cyklu Krebsa, np. izocytrynianowa, bursztynianowa i inne. Indukowana jest natomiast synteza
enzymów szlaku EMP (fermentacja alkoholowa).

Wykazano, że nie tylko wysokie stężenie glukozy, ale duża szybkość wzrostu drożdży sprzyja

procesowi fermentacji alkoholowej. Przykładowo – przy właściwej szybkości wzrostu

= 0,1 h

-1

fermentacja

tlenowa zachodzi powyżej 2 g glukozy w litrze, przy

= 0,2 h

-1

ten sam efekt fizjologiczny uzyskuje się przy

stężeniu glukozy 1g w litrze. Uważa się, że nie sama glukoza, jako związek chemiczny, lecz szybkość przemian
katabolicznych decyduje o kierunku jej metabolizmu. Wynika z tego, że warunki natlenienia, stężenie glukozy
i szybkość jej metabolizmu wpływają na wydajność masy komórkowej. Przy wysokim stężeniu glukozy i dużej
szybkości wzrostu drożdży, wydajność biomasy w warunkach tlenowych ulega redukcji, gdyż przy
dostatecznym poziomie ATP, zabezpieczającym potrzeby energetyczne komórki, nadmiar substratu
oddechowego NADH powoduje hamowanie procesów związanych z pozyskiwaniem energii metabolicznej.
Nadmiar NADH sprzyja też redukcji metabolitów powstających w procesie glikolizy. W wyniku takiej
gospodarki równoważnikami redukującymi, w warunkach dobrego natlenienia i dużego stężenia glukozy,
powstają normalne produkty fermentacji, np. etanol, czy kwas mlekowy, analogicznie jak w procesie
beztlenowym. Zjawisko to jest wykorzystywane w początkowych etapach propagacji drożdży. Produkcja
niewielkich ilości etanolu daje dodatkowy efekt sterylizujący i zabezpiecza przed rozwojem niepożądanej
mikroflory.

Natlenienie pożywek
Efektywność procesów tlenowych zależy w dużym stopniu od szybkości tranferu tlenu z fazy gazowej

do ciekłej. Parametr ten jest determinowany przez następujące czynniki:

stopień dyspersji pęcherzyków powietrza w fazie wodnej, co wpływa na powierzchnię wymiany
międzyfazowej

szybkość mieszania cieczy, co wpływa na rozdrobnienie pęcherzyków oraz czas ich przebywania
w cieczy

temperatura cieczy; zgodnie z prawem Henry’ego, rozpuszczalność gazów w cieczy maleje w miarę
wzrostu temperatury; woda o temp. 25

C może przyjąć max 20 mg tlenu na litr; pożywki

mikrobiologiczne ciekłe są zdolne do rozpuszczenie ok. 5-7 mg tlenu na litr

obecność w cieczy substancji rozpuszczonych (sole, cukry, białka); im większe ich stężenie tym niższa
rozpuszczalność tlenu w cieczy

obecność substancji obniżających napięcie powierzchniowe cieczy (niekorzystnie oddziałują na transfer
tlenu do cieczy)

stopień nasycenia tlenem danej cieczy; im większa jest różnica między stanem nasycenia tlenem
a stanem faktycznym, tym szybszy jest transfer tlenu do cieczy.

Zwiększenie transferu tlenu do cieczy można technicznie osiągnąć przez:

zwiększenie szybkości mieszania (zwiększenie powierzchni kontaktu gaz-ciecz)

zwiększenie napowietrzania (tzn. dostarczenie większej ilości tlenu)

METODY HODOWLI MIKROORGANIZMÓW

Hodowle okresowe (batch culture) – są najczęściej stosowaną metodą hodowli mikroorganizmów. Metoda
okresowa ma wady, z których najważniejszymi są: zmienność środowiska w czasie hodowli wynikająca ze
zmiany stężenia składników pokarmowych i nagromadzenia toksycznych metabolitów oraz stosunkowo niską
gęstość kultury komórkowej i tym samym niewielka produktywność objętościowa bioreaktora. W procesach
okresowych nie wykorzystuje się w pełni potencjału metabolicznego komórek, gdyż optymalne warunki dla ich
rozwoju utrzymywane są tylko przez krótki czas hodowli. Jednym ze sposobów redukcji tego problemu jest
zastosowanie okresowo-dolewowej, półciągłej lub ciągłej metody hodowli.

Hodowle ciągłe – polegają na stałym zasilaniu kultury świeżą pożywką z jednoczesnym usuwaniem zużytego
medium wraz z komórkami lub bez komórek. Metoda ta jest dostosowana głównie do produkcji biomasy
komórkowej lub jej pierwszorzędowych metabolitów. Wzrost komórek odbywa się cały czas w logarytmicznej
fazie wzrostu, przy całkowitym braku ograniczających ich rozwój.
Najprostszą technologią procesów ciągłych jest zastosowanie reaktora przepływowego ze stałym dostarczaniem
ś

wieżej pożywki i odbieraniem zużytej wraz z komórkami przy zachowaniu stałej objętości roboczej

bioreaktora. Warunkiem utrzymania hodowli ciągłej jest zachowanie równowagi pomiędzy ilością komórek
wymywanych i ponownie namnożonych w wyniku podziałów komórkowych. Szybkość pożywki powinna być
tak dobrana, by zapewnić stałą, wysoką koncentrację komórek w bioreaktorze i utrzymanie hodowli w stanie
chemostatu. W tym przypadku gęstość komórek i stężenie substratu mają wartości stałe, a więc miernikiem
właściwej szybkości wzrostu komórek jest szybkość rozcieńczania pożywki.

Hodowle okresowo-dolewowe (fed-batch culture) polega na wprowadzeniu do hodowli pod koniec fazy
logarytmicznego wzrostu świeżej pożywki lub mieszaniny najważniejszych jej składników. W tym przypadku
początkowe wypełnienie bioreaktora wynosi 30-50 % a kolejne porcje pożywki są dostarczane ze stałą lub
zmienną szybkością. W metodzie FBC występują tylko 2 fazy cyklu komórkowego: fazy logarytmiczne
oddzielone krótkotrwałymi fazami adaptacyjnymi, zapoczątkowanymi przez wprowadzenie świeżej pożywki.
Dlatego, hodowle okresowo-dolewowe, w porównaniu z hodowlami okresowymi, pozwalają na uzyskanie
kilkukrotnie większych gęstości komórek i produktywności bioreaktora.
Innym sposobem prowadzenia hodowli okresowo-dolewowej jest metoda półciągła, która realizowana jest przez
okresowe odbieranie części hodowli i zastępowanie jej porcją świeżej pożywki.

Proces ciągły wyróżnia się wieloma zaletami, do których należą:

wyeliminowanie wpływu czasu hodowli na zmiany warunków hodowli i fizjologię komórek

możliwość prowadzenia hodowli dowolnie długo w ustalonych, najbardziej korzystnych warunkach

możliwość regulacji stanu fizjologicznego komórek przez dobór szybkości zasilania i składu podłoża
zasilającego hodowlę

stosunkowo duża jednorodność fizyczna i chemiczna hodowli

możliwość automatyzacji procesów

możliwość maksymalnego wykorzystania aparatury przy jednoczesnym równomiernym jej obciążeniu
przez cały czas trwania procesu.

W hodowlach ciągłych mogą pojawiać się problemy związane z niestałością czynnika biologicznego, np.:

degeneracja szczepów lub pojawienie się niekorzystnych mutacji i opanowanie hodowli przez populacje
komórek o pogorszonych właściwościach produkcyjnych

trudności w utrzymaniu warunków aseptycznych procesu w bioreaktorze przez dłuższy czas

niekorzystny dla hodowli ciągłej sposób rozwoju niektórych droboustrojów, tworzących układy
wielkokomórkowe, skupiska w postaci kłaczków i kuleczek a także układy wielkokomórkowe, skupiska
w postaci kłaczków i kuleczek a także tendencja do obrastania przewodów i innych elementów
bioreaktora

niekorzystna relacja pomiędzy wzrostem drobnoustrojów a tworzeniem niektórych produktów
metabolizmu syntetyzowanych przez komórki nie rosnące

niedostateczna znajomość dynamicznych właściwości drobnoustrojów w hodowli ciągłej.

A = x

= x

A/B x

B – x

= x

⋅

logx

= logx

+ nlog2

max

= const

wielkość komórek i zawartość białka = const

max

⋅

S/(K

+ S)

właściwa szybkość wzrostu:

;

(stan końcowy/stan początkowy komórki);

czas generacji (by komórki podwoiły się)

-.8

częstość podziałów komórkowych

WYKONANIE ĆWICZENIA

Zadanie 1: badanie przyrostu biomasy drożdży.

•

zważyć naczynia wirówkowe

•

do naczyń należy odmierzyć po 25 ml brzeczki z hodowli początkowej i końcowej

•

dla oddzielenia biomasy naczynia z zawartością wirować przy szybkości 5500 [obr./min] 10 min

•

po wirowaniu supernatanty zlać do zlewek (do zad. 2) a pozostałość zważyć (znad osadu, określić ilość

glukozy i azotu, mokrą biomasę należy wysuszyć)

•

obliczenia:

obliczyć suchą masę komórek w 100 ml brzeczki wiedząc, że żywa komórka zawiera 25 % s.m. (75 %
to woda);

25 % - 100 ml
x – 25 ml
x = 6,25 %

obliczyć masę i przyrost komórek drożdży w pobranych próbach

obliczyć masę i przyrost komórek drożdży w 1000 ml brzeczki (D

)

Zadanie 2: badanie stopnia odfermentowania glukozy.

•

próby rozcieńczyć

- hodowla końcowa – 5 i 10

⋅

(1 ml + 4 ml wody; 1 ml próby + 9 ml wody; po 2 próby)

- hodowla początkowa – 100 i 150x

•

z rozcieńczeń pobrać 0,5 ml próby i dodać 0,5 ml DNS-u. Oznaczenia wykonać w 2 powtórzeniach

•

przygotować próbę „0” o składzie: 0,5 ml wody destylowanej i 0,5 ml DNS

•

próby ogrzewać 10 min we wrzącej łaźni wodnej a następnie ostudzić w strumieniu zimnej wody

•

dodać 5 ml wody destylowanej, dokładnie wymieszać

•

zmierzyć absorbancję na spektrofotometrze przy długości fali

= 530 nm stosując próbę „0” do

kalibracji spektrofotometru

•

stężenie glukozy odczytać z krzywej wzorcowej.

Zadanie 3: badanie stopnia wykorzystania azotu z pożywki.

•

doświadczenie przeprowadzić z zastosowaniem aparatu Parnasa

•

w rozgrzanym aparacie Parnasa należy umieścić 10 ml badanej próby

•

dodać ok. 20 ml 40 % NaOH (w obecności fenoloftaleiny – kolor różowy)

•

destylować amoniak do 20 ml kwasu bornego z odczynnikiem Tashiro do zmiany barwy + 5 min

•

zmiareczkować azot amonowy za pomocą 0,1 N H

do zmiany barwy z zielonej na fioletową

•

obliczenia:

stopień odfermentowania cukru:

GLC

pobrana

= GLC

początkowa

– GLC

końcowa

glc

= (GLC

pobrana

/GLC

początkowa

) x 100 %

wydajność przyrostu biomasy:

dB (przyrost biomasy) = masa biomasy z końca hodowli – masa biomasy z początku hodowli
WdB = (dB/GLC

pobrana

)

⋅

100 %

azot NH

pobrany z 1000 ml pożywki:

= (V

– V

)

⋅

100, gdzie:

– objętość 0,1N H

zużyta do zmiareczkowania próby początkowej

Vk – objętość 0,1N H

zużyta do zmiareczkowania próby końcowej

pobrany

= (V

⋅

0,0014 g

⋅

18 g)/14 g

(1ml 0,1N H

odpowiada 0,0014 g N; 1M NH

= 18g; 1MN = 14 g)

przyrost biomasy na podstawie ubytku N z pożywki:

ilość powstałego białka (P) = NH

pobrany

⋅

6,25

przyrost biomasy (dB) = B

⋅

mnożnik białka = 6,25
Białko zawiera stałą ilość azotu = 16 % co stanowi 6,25 części wszystkich pierwiastków występujących w białku
(100:16 = 6,25), mnożąc ilość azotu

⋅

6,25 otrzymujemy ilość powstałego białka.

Biomasa drożdżowa zawiera duże ilości białka, ok. 50 %, dlatego, by je obliczyć mnożymy ilość białka

⋅

Indukcja syntezy enzymów produkowanych przez Aspergillus niger

Cel ćwiczenia – wykazanie możliwości indukowania produkcji pożądanych enzymów przez
drobnoustroje.

Wprowadzenie.

2.1.

Indukcja syntezy enzymów przez drobnoustroje.

Większość enzymów wykorzystywanych w procesach biosyntezy i biotransformacji produkowanych

jest przez drobnoustroje. W przemyśle wykorzystuje się proteazy,

-amylazy, amyloglukozydazę, aminoacytazę,

dekstranazę, katalazę. W celach leczniczych pozyskuje się enzymy trawienne, heparynę, streptolizynę.
W mniejszych ilościach produkuje się też enzymy służące do celów analitycznych w biologii molekularnej czy
w inzynierii genetycznej (np. restryktazy).

Część enzymów jest syntetyzowana wewnątrz organizmu konstruktywnie, niezależnie od warunków

rodowiskowych. Dotyczy to głównie enzymów katalizujących reakcje przemian centralnych i podstawowych

syntez komórkowych.

Większość ważnych biotechnologicznie enzymów należy do grupy induktywnych, tzn. takich, których

synteza wymaga obecności induktora w środowisku zewnętrznym. Induktorami są substraty, rzadziej produkty
reakcji enzymatycznych albo też ich analogi.

Najlepiej poznanym przykładem enzymu jest produkcja

-galaktozydazy przez bakterie Escherichia

coli. Komórki tego organizmu mogą rozwijać się na wielu substratach nie produkując prawie w ogóle

galaktozydazy. Jeżeli jednak w podłożu hodowlanym znajdzie się laktoza – substrat dla

-galaktozydazy – to

aktywność tego enzymu może wzrosnąć tysiąckrotnie.

Synteza indukowanego enzymu ulega najczęściej represji w obecności końcowych produktów degradacji

substratu. Represorami mogą więc być aminokwasy przy produkcji proteaz czy też np. glukoza przy produkcji
aminoglukozydazy czy izomerazy glukozowej.

Mechanizmy regulujące powstawanie enzymów konstytutywnych jak i induktywnych działają na

poziomie molekularnym, przede wszystkim na etapie transkrypcji DNA i w mniejszym stopniu na etapie
translacji. W pierwszym przypadku regulacja dotyczy oddziaływań białek regulatorowych (indukujących lub
represorowych) na geny promotora i operatora, które umożliwiają przyłączenie się polimerazy RNA do nici
DNA i tym samym na rozpoczęcie transkrypcji mRNA.

Regulacja na etapie translacji polega na różnej częstości syntezy białek enzymatycznych lub też

związana jest z translacyjnym modyfikowaniem białek, ułatwiającym ich przejście przez błony
wewnątrzkomórkowe (przez aparat Golgiego) i tym samym wyjście poza teren komórki.

2.2 Separacja enzymów.

Wyprodukowane przez drobnoustroje enzymy znajdują się bądź to wewnątrz komórek, lub też

w podłożu hodowlanym. Enzymy wewnątrzkomórkowe są zazwyczaj mniej stabilne i charakteryzują się większą
masą cząsteczkową. Proces ich separacji należy rozpocząć od rozbicia komórek, co wiąże się z tym, że do
roztworu przechodzą również wszystkie inne białka obecne w cytoplazmie, a także cały kompleks kwasów
nukleinowych.

Dalsze postępowanie zarówno z enzymami wewnątrzkomórkowymi jak i zewnątrzkomórkowymi jest

podobne. Jedną z metod pozyskiwania enzymów jest ich wydzielanie z roztworów na zasadzie różnicy
rozpuszczalności białek. Dodając do roztworu sole nieorganiczne (np. siarczan amonowy, magnezowy lub
sodowy), rozpuszczalniki organiczne (np. etanol, aceton) czy też rozpuszczalne polimery niejonowe (np. glikol
polietylenowy, dekstran) w odpowiednim stężeniu powoduje się wypadanie białka z tegoż roztworu. Tak
uzyskaną zawiesinę odwirowuje się, a z otrzymanego precypitatu usuwa się czynnik denaturujący, przez co
enzym odzyskuje swą aktywność.

Stosując wyżej wymienione sposoby można pozyskać 80-90 % pożądanego enzymu.

Oczyszczanie enzymów można prowadzić również poprzez denaturację termiczną; ogrzewanie

roztworu oczyszczanego enzymu w temperaturze nieco niższej od temperatury, w której traci on aktywność,
prowadzi najczęściej do wytrącania się wieku białek towarzyszących. Temperaturę ogrzewania można
podwyższyć nie powodując inaktywacji enzymu, gdy do roztworu zostanie dodany związek swoiście się z tym
enzymem łączący.

Zmiana pH roztworu lub też obniżenie jego siły jonowej do bardzo niskich wartości może również

doprowadzić do usunięcia wielu białek towarzyszących.

Bardzo szeroko stosowanymi metodami rozdziału białek są metody chromatograficzne. Obejmują one

następujące sposoby frakcjonowania:

•

sączenie molekularne – technika wykorzystująca różnice w wielkości rozdzielanych cząstek;
mieszanina substancji o różnej masie cząsteczkowej przepływa przez kolumnę wypełnioną porowatym
hydrofilnym żelem o określonej wielkości porów, zrównoważonym odpowiednim buforem; cząsteczki
zbyt duże, aby wniknąć do ziaren żelu, przepływają między nimi i pojawiają się w eluacie lako
pierwsze, substancje o niższej masie cząsteczkowej wnikają do ziaren żelu, są więc opóźniane na
kolumnie; pojawiają się w eluację w porządku od najmniejszych do największych

•

chromatografia jonowymienna – kolumna chromatograficzna wypełniona jest celulozowym
wypełniaczem jonowym, do którego wiążą się białka obdarzone przeciwnym niż wymieniacz
ładunkiem, białka obdarzone tym samym ładunkiem przepływają swobodnie przez kolumnę. Białka
połączone z wypełniaczem uwalnia się poprzez wprowadzenie do układu czynników konkurujących
z białkami o miejsce na wypełniaczu

•

chromatografia

adsorpcyjna

–

kolumna

wypełniona

jest

nieorganicznym

materiałem

(np. hydroksyapatyt), który adsorbuje białko na zasadzie oddziaływań Van der Waals’a

•

chromatografia powinowactwa – rzadko stosowana na większą skalę ze wzgl. na wysokie koszty
i niestabilność wypełniacza kolumny, który powinien być specyficzny dla danego enzymu, gdyż
ligandem, do którego wiąże się pozyskiwany enzym jest w tym przypadku substrat danego enzymu,
jego analog bądź też inhibitor enzymu.

W ostatnich latach rozdział enzymów na skalę przemysłową prowadzony jest przy użyciu technik

membranowych, do których należy ultrafiltracja. Przepuszczając oczyszczany roztwór przez membranę
o zdefiniowanej porowatości można uzyskać zagęszczony enzym, nieposiadający zanieczyszczeń w postaci soli
czy niskocząsteczkowych związków. Frakcjonowanie odbywa się tu na zasadzie różnicy w rozmiarach
cząsteczek, co ma odniesienie do ich masy cząsteczkowej.

Wykonanie ćwiczenia

•

indukcja syntezy amylazy i pektynazy przez Aspergillus niger

Przygotować podłoże hodowlane o następującym składzie:

MgSO

⋅

KCl
NaNO

FeSO

⋅

MgSO

CaCl

0,5 [g/l]
1,0 [g/l]
0,5 [g/l]
3,0 [g/l]
0,01 [g/l]
0,24 [g/l]
0,15 [g/l]

Jako substraty indukujące wytwarzanie enzymów do części podłoża dodać:

10 g/l skrobi rozpuszczalnej (indukcja syntezy amylazy)

0,01 g/l kwasu poligalakturonowego (indukcja syntezy pektynazy).

Ustalić pH = 5,6 i sterylizować 117

C pod ciśnieniem 0,8 atm. przez 0,5 h.

Tak przygotowane podłoże zaszczepić grzybnią Aspergillus niger, hodowlę prowadzić w kolbach Erlenmayer’a
250 ml w temperaturze 30

C na wytrząsarce przy 150 [obr./min] przez 70 h.

•

oznaczanie aktywności pektynolitycznej i emylolitycznej w płynach pohodowlanych

Po 70 h hodowli zawartość kolbek odsączyć na lejku w celu oddzielenia komórek grzybowych od roztworu
zawierającego enzymy. W otrzymanym przesączu sprawdzić aktywność obu badanych enzymów. W celu
sprawdzenia aktywności pektynolitycznej do probówki zawierającej 0,5 ml 0,5 % kw. poligalakturonowego
dodać 0,5 ml badanego roztworu. Całość inkubować 30 min w 50

C, w łaźni wodnej. Następnie dodać 1 ml

DNS, gotować przez 10 min., próbki ochłodzić pod bieżącą wodą, dodać 10 ml wody destylowanej, dokładnie
wymieszać i prowadzić odczyt na spektrofotometrze przy długości fali A = 530 nm. Z krzywej wzorcowej dla
kwasu galakturonowego odczytać jego zawartość i na tej podstawie obliczyć aktywność badanego enzymu,
wyrażając ją poprzez szybkość powstawania produktu (np.

g/ml/min.).

W analogiczny sposób przeprowadzić oznaczenia aktywności amylolitycznej.
Uwaga: aktywności obu enzymów sprawdzić we wszystkich płynach pohodowlanych) pochodzących z hodowli
beż żadnej indukcji, w przypadku indukcji syntezy amylazy oraz w przypadku indukcji syntezy pektynazy).

Hodowla A. niger na podłożu:

bez induktora – hodowla kontrolowa

ze skrobią – indukcja syntezy amylazy

z kw. poligalakturonowym – induktorem syntezy pektynazy

Przygotowanie prób do analizy:
Próby właściwe:

⋅

0,5 ml skrobi + 0,5 ml (podłoża) enzymu

⋅

0,5 ml kw. poligalakturonowego + 0,5 ml enzymu

próby zerowe substratowe:

⋅

0,5 ml skrobi + 0,5 ml H

⋅

0,5 ml kw. + 0,5 ml H

próba zerowa enymatyczna:

⋅

0,5 ml enzymu + 0,5 ml H

Indukcja ze wzgl. na miejsce grom.:

konstytutywna – syntetyzowane niezależnie od środowiska gromadzenie wewnątrz komórki; katalizują
reakcje przemian centralnych i podstawowych syntez komórkowych

induktywna – synteza jest uzależniona od obecności induktora w środowisku zewnętrznym (mogą być
substraty, produkty reakcji lub ich analogi).

KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH.

INHIBICJA. TERMOSTABILNOŚĆ.

Celem badań kinetyki reakcji enzymatycznych jest uzyskanie informacji o ich przebiegu w czasie,

a więc zaniku substratów i powstawania produktów, liczby i kolejności przyłączania cząsteczek substratów do
enzymu i odłączania cząsteczek produktów z kompleksu aktywnego, liczby kompleksów pośrednich oraz
o efektach czynników modyfikujących przebieg reakcji – inhibitorów i aktywatorów. Badania te prowadzą do
stworzenia modelu kinetycznego reakcji uwzględniającego wszystkie etapy reakcji. Każdy etap charakteryzują
2 wielkości, noszące nazwę stałych szybkości reakcji, które pozwalają sprawdzić, czy przyjęty model kinetyczny
dobrze opisuje badany układ. Doświadczenie stałych szybkości reakcji jest bardzo uciążliwe.

Przy pomocy modelu kinetycznego można przewidywać szybkość i kierunek przebiegu danej reakcji

w łańcuchu lub cyklu metabolicznym, czyli może on być podstawą do określenia katalitycznej sprawności
enzymu w organizmie.

Aktywność enzymu określa nam ilość enzymu niezbędną do wytworzenia określonej ilości produktu

reakcji w określonej jednostce czasu przy zachowaniu standardowych warunków oznaczenia, zwykle
optymalnych dla działania enzymu.

Oznaczanie aktywności enzymów prowadzi się różnymi metodami, opierającymi się na pomiarze ilości

wytworzonego produktu, ilości zużytego substratu, względnie zmian fizykochemicznych w środowisku
reakcyjnym (np. zmiany lepkości, zmiany pH, zużycia tlenu).

Szybkość przebiegu reakcji enzymatycznej zależy od wielu czynników środowiskowych, tj. stężenie

enzymu, stężenie substratu. Temperatura, pH, siła jonowa, potencjał oksyredukcyjny, obecność inhibitorów
i aktywatorów.

O kierunku przebiegu reakcji decydują przede wszystkim stężenie substratu i produktów reakcji.

Przy wysokim stężeniu substratu, a tak jest zwykle na początku reakcji, reakcja przebiega w kierunku tworzenia
się produktów. Ilość reagującego substratu jest tym większa, im większa jest koncentracja enzymu na początku
rekcji, co gwarantuje natychmiastowy kontakt wszystkich cząsteczek enzymu z substratem. Zaznaczyć jednak
należy, że w sytuacji, gdy cała ilość substratu jest związana z enzymem, nadmiar enzymu jest praktycznie
bezużyteczny.

Na początkową szybkość reakcji decydujący wpływ ma stężenie substratu. Wraz ze wzrostem stężenia

krzywa V-S przybiera formę hiperboliczną, co oznacza, ze tempo wzrostu szybkości reakcji maleje w miarę
wzrostu stężenia substratu, dochodząc do wartości maksymalnej. Przy dalszym dodatku substratu wartość V

max

nie ulega zmianie, co związane jest z pełnym wysyceniem cząsteczek enzymu przez substrat. Wzrost V

max

może

mieć miejsce wówczas, gdy w mieszaninie reakcyjnej zostanie zwiększone stężenie enzymu. Powyższy opis
obrazuje następujący rysunek:

•

Kinetyka hiperboliczna reakcji z 1 substratem.
Nieodwracalna reakcja enzymatyczna przebiega wg schematu:

A + E

↔

→

E + P

W schemacie tym A, E, P, i EA oznaczają kolejno substrat, enzym, produkt i kompleks przejściowy lub

aktywny. Substraty, produkty, inhibitory i inne czynniki biorące udział w reakcji nazywamy reaktantami.
Enzym, po rozpadzie kompleksu aktywnego wchodzi powtórnie w reakcję, katalizując przemianę następnej
cząsteczki substratu.

Zmiany stężenia poszczególnych składników reakcji enzymatycznej przedstawiono na rysunku:

Na powyższym wykresie literami a, b i c oznaczono stany przebiegu reakcji. Litera „a” to stan prestacjonalny, tj.
okres początkowy reakcji, poprzedzający ustalenie stanu stacjonarnego. „b” to stan stacjonarny, w którym
stężenie kompleksu aktywnego EA jest wartością stałą. Później następuje stan poststacjonarny „c”, który posiada
małe znaczenie w badaniach kinetyki reakcji enzymatycznych.

Interpretacja kinetyki hipernolicznej w ujęciu Michaelis’a-Menten

Interpretacja kinetyki hipernolicznej opiera się na założeniu, że podczas przebiegu reakcji enzymatycznej istnieje
taki stan, w którym stężenie kompleksu EA jest wielkością stałą.

SCHEMAT NIEODWRACALNEJ REAKCJI ENZYMATYCZNEJ:

> ?

BC >?

BC ?

ZAŁOśENIE: Istnieje taki moment reakcji, w którym szybkość syntezy kompleksu enzym-substrat równa się
szybkości jego rozpadu ([EA] = const)

[A][E] = k

-1

[EA] + k

[EA]

ponieważ:

[E] = [E

] – [EA]

to:

[A][E

] - k

[A][EA] = k

-1

[EA] + k

[EA]

[A][E

] = [EA] (k

[A] + k

-1

+ k

)

3?>7

3>73?

3>7 G

ponieważ szybkość powstawania produktu wynosi: V

= k

[EA]

3>73?

3>7 G

zakładając, że:

max

= k

]

3>7

Wartość K

jest miarą powinowactwa enzymu do substratu; większe K

– mniejsze powinowactwo. K

jest to

taka ilość substratu, przy której reakcja enzymatyczna przebiega z połową maksymalnej szybkości.

Aby uniknąć trudności w określaniu wartości V

max

i K

kinetykę reakcji przedstawia się w formie

wykresu Lineweavera-Burka (linearyzacja Lineweavera-Burka – jest to odwrotność końcowego wzoru w teorii
Michaelis’a-Menten).

KLM

6
N

O 0

⇒

P Q

S I 0

⇒

!
N

•

Metody relaksacyjne w badaniach mechanizmów reakcji enzymatycznych.

Metody relaksacyjne opierają się na wywołaniu chwilowych zaburzeń w układzie znajdującym się w stanie
równowagi termodynamicznej i następnie obserwacji kinetyki ustalania się nowego stanu równowagi
termodynamicznej, czyli relaksacji. Szybkość ustalania się nowego stanu jest miarą szybkości reakcji
przebiegających w badanym układzie.

W badaniach biologicznych najczęściej stosowane są badania relaksacji ciśnieniowej i temperaturowej

(metody skoku ciśnienia lub temperatury).

•

Hamowanie reakcji enzymatycznych.

Szybkość reakcji enzymatycznych może być znacznie ograniczona przez czynniki środowiskowe. Ich działanie
można określić jako:
niespecyficzne – pH, temperatura, metale ciężkie itp. powodują najczęściej nieodwracalną inaktywację białek
enzymatycznych;
specyficzne – niektóre związki modyfikują cząsteczkę enzymu (blokada centrum aktywnego, modyfikacja
struktury przestrzennej), przy czym modyfikacja taka jest z reguły odwracalna.

Temperatura jest jednym z czynników istotnie wpływających na szybkość reakcji enzymatycznych.

Wraz z jej wzrostem wzrasta szybkość katalizowanych przez enzymy reakcji. Jednakże w podwyższonej
temperaturze dochodzi na ogół do denaturacji cieplnej enzymów, a przez to do ich inaktywacji. Większość
enzymów posiada optimum swojego działania w temperaturze 30-50

C. Natomiast już kilkuminutowa

inkubacja w temp. 70

C inaktywuje większość znanych do tej pory enzymów, choć istnieją też także enzymy,

które pełnią aktywność nawet po inkubacji w 100

W niektórych przypadkach te same enzymy, ale izolowane z 2 różnych organizmów charakteryzują się

różną termostabilnością.

-amylaza z Bacillus stearotermophilius charakteryzują swą aktywność po inkubacji

w 90

C, natomiast ten sam enzym izolowany z Aspergillus oryzae ulega pełnej inaktywacji już po 15 min

inkubacji w 60

Denaturacja termiczna w odniesieniu do niektórych enzymów jest odwracalna. Przykładem jest tu

pirofosforaza nukleotydowa z Proteus vulgaris. Enzym ten traci całkowicie aktywność po 10 min inkubacji
w 70

C, ale odzyskuje ją całkowicie po ochłodzeniu do 37

Inaktywacja enzymów może również następować w temperaturach poniżej 10

C. W tych przypadkach

zjawisko to ma charakter bardziej kompleksowy, gdyż szybkość inaktywacji zależy tu również od stężenia
enzymu, stężenia soli i pH środowiska. Taka inaktywacja dotyczy prawdopodobnie tylko enzymów
oligometrycznych, które w obniżonej temperaturze dysocjują na podjednostki, a po ponownym podwyższeniu
temperatury podjednostki te nie asocjują się już w aktywny enzym (np. dekarboksylacja glutaminowa z E. coli).

Enzymów inaktywujących się w niskich temperaturach jest jednak bardzo mało; większość enzymów

ulega inaktywacji w podwyższonej temperaturze.

Istnieje możliwość wpływania na termo-stabilność enzymów poprzez stosowanie związków

ochronnych, które wiążą się z enzymem, przez co obserwuje się mniejszy spadek jego aktywności. Stabilizująco
działają substraty i analogi strukturalne, jony metali, koenzymy, a także stabilizatory nieswoiste – albuminy
osocza, dekstran, glikol polietylenowy (PEG), glicerol.

ŹRÓDŁA ENZYMÓW

Enzymy pochodzenia roślinnego:

peroksydaza - chrzan

proteinazy – fasola szparagowa

-amylaza – jęczmień, słodkie ziemniaki

Enzymy pochodzenia zwierzęcego:

katalaza – bydło

lipaza – świnia

lizozym – jaja kurze

pepsyna – świnia

-amylaza - świnia

Enzymy pochodzenia mikrobiologicznego:

•

enzymy wytwarzane przez bakterie:

katalaza – Micrococcus lysodeiktus

proteazy – Bacillus sp., Streptomyces sp.

kolagenaza – Clostridium histoliticum, Rydopseudomonas spheroides

-amylaza – Bacillus sp.

-galaktozydaza – Escherichia coli

•

enzymy wytwarzane przez grzyby:

glukozydaza – Aspergillus niger

lipaza – Aspergillus sp., Mucor sp., Rhizopus sp.

-amylaza - Aspergillus sp.

amyloglukooksydaza - Aspergillus niger

-1,3-glukanaza – Basidomycete sp., Sclereltina libertiana

pektynazy - Aspergillus niger

celulazy – Trichoderma viride, Basidomyces sp.

proteazy - Aspergillus sp., Tritirachium sp.

Biorąc pod uwagę rodzaj oddziaływania między cząsteczkami enzymu i inhibitora inhibicję specyficzną

dzielimy na 3 typy:

inhibicja współzawodnicza (kompetycyjna) – polega na konkurencji pomiędzy inhibitorem

i substratem o centrum aktywne enzymu; inhibitory tego typu są zwykle podobne pod wzgl. struktury
chemicznej do substratu; inhibicję tego typu można zwykle znieść przez zwiększenie stężenia substratu; przy
tego typu inhibicji zmniejsza się powinowactwo enzymu do substratu (K

rośnie), V

max

nie zmienia się

inhibicja niewspółzawodnicza (niekompetycyjna) – inhibitor tak wiąże się z enzymem, że zmienia

jego aktywność katalityczną; maleje V

max

powinowactwo pozostaje na tym samym poziomie

= const)

inhibicja allosteryczna – inhibitor tak modyfikuje cząsteczkę enzymu, że zmienia się zarówno

powinowactwo enzymu do substratu (K

) jak i szybkość maksymalna (V

max

); przykładem tego typu inhibicji

może być inhibicja przez sprzężenie zwrotne, gdzie produkt reakcji hamuje jeden z pierwszych etapów tej
reakcji.

Na rysunku przedstawiono graficzną interpretację różnych typów inhibicji na wykresie Lineweavera-Burka.

Wykonanie ćwiczenia

Określić wpływ zmiennego stężenia substratu na szybkość reakcji enzymatycznej.

Przeprowadzić hydrolizę enzymatyczną skrobi stosując następujące stężenia substratu: 0,2 %, 0,4 %,

0,6 %, 0,8 %, 1,0 %. Na podstawie otrzymanych wyników przedstawić graficznie przebieg reakcji (wg metody
linearyzacji Lineweavera-Burke’a) oraz wyznaczyć kinetyczne stałe reakcji K

i V

max

. (inhibitor: maltoza

0,025%)

Określić przebieg hydrolizy skrobi w obecności inhibitorów (0,05 % maltoza).

Przeprowadzić hydrolizę skrobi (0,2 %, 0,4 %, 0,6 %, 0,8 %, 1,0 %) w obecności 0,05 % maltozy.

Otrzymane wyniki przedstawić graficznie w formie liniowej na rysunku wykonanym w p.1. Na tej podstawie
określić typ inhibicji.
Próby właściwe (2

⋅

) 0,5 ml skrobi + 0,5 ml enzymu.

Zerowe substratowe (1

⋅

) 0,5 ml skrobi + 0,5 ml H

Zerowe enzymatyczne (1

⋅

) 0,5 ml enzymu + 0,5 ml H

Oznaczanie aktywności amylolitycznej.

W celu sprawdzenia aktywności amylolitycznej do probówki zawierającej 0,5 ml buforowanego

roztworu 1 % skrobi wprowadzić 0,5 ml badanego enzymu. Całość inkubować w łaźni wodnej przez 30 min

w 50

C. Następnie dodać 1 ml DNS (kwas 2,3,3-dinitrosalicylowy); powstaje barwny kompleks w 100

z cukrami od pomarańczowego do brązowego; i gotować przez 10 min. Po tym czasie reakcję przerwać poprzez
schłodzenie próby pod bieżącą wodą, do probówek dodać 10 ml wody destylowanej i po wymieszaniu
prowadzić odczyt na spektrofotometrze przy długości fali A = 530 nm. Z krzywej wzorcowej odczytać
zawartość glukozy w próbce i na tej podstawie określić aktywność enzymu amylazy, wyrażając ją poprzez
szybkość przebiegu reakcji, czyli w tym przypadku jako ilość powstałej glukozy w jednostce objętości
i w jednostce czasu (np. mg/l/min)

IMMOBILIYACJA BIOKATALIYATORÓW

Cel ćwiczenia:

•

Zapoznanie się z metodami unieruchamiania enzymów i komórek mikroorganizmów

•

Immobilizacja komórek drożdży Saccharomyces ceresevisiae w żelu alganinianowym oraz poprzez
mikrokapsułkowanie

Wprowadzenie

Większość procesów biotechnologicznych polega na przeprowadzeniu cyklu reakcji biochemicznych,

w których wyjściowy substrat jest przekształcany w produkty końcowe. Procesy takie wymagają
wieloskładnikowych kompleksów enzymatycznych, które mogą być wprowadzane do reakcji w formie
handlowych preparatów enzymatycznych. Najczęściej reakcje takie wymagają udziału wielu enzymów
zastosowanych w ściśle określonych stężeniach i wzajemnych proporcjach, co z technologicznego punktu
sterowania takim procesem jest bardzo trudne, a także kosztowne.

Dlatego też znacznie korzystniejsze jest im mobilizowanie całej komórki mikroorganizmu jako źródła

enzymów. Taki proces jest dużo tańszy, gdyż pomija się etapy izolacji i oczyszczania enzymów.

Immobilizacja oznacza zatem fizyczne lub chemiczne unieruchomienie biokatalizatora poprzez

związanie go z nośnikiem lub umiejscowienie w określonej przestrzeni bez użycia makroskopowego nośnika.

Systemy oparte na wykorzystaniu im mobilizowanych biokatalizatorów wykazują wiele zalet

w porównaniu z systemem wolnych komórek i enzymów.

•

możliwość wielokrotnego użycia i wykorzystania w procesach ciągłych

•

możliwość wprowadzenia do reakcji całego kompleksu enzymatycznego jednocześnie, co ułatwia

przeprowadzenie ciągów katalizowanych reakcji i polepsza wykorzystanie potrzebnych ko faktorów, które są
regenerowane przez kompleks enzymatyczny

•

łatwość wydzielania produktu i biokatalizatora z mieszaniny poreakcyjnej

•

wyższa reaktywność, przedłużona trwałość katalityczna enzymu

•

dodatni wpływ na biologiczne właściwości mikroorganizmów – komórki są wówczas mniej podatne na

efekty związków hamujących, mają większą stabilność termiczną i chemiczną a powstające tą drogą produkty
nie są zanieczyszczone białkami pochodzącymi z lizy komórek

•

możliwość wprowadzania do reakcji dużej koncentracji komórek co przyspiesza tempo procesu

•

możliwość zwiększania szybkości rozcieńczania bez obawy wymycia populacji mikroorganizmów, do

którego dochodzi podczas procesów z komórkami wolnymi

•

obniżone koszty procesów biotechnologicznych.

Typy immobilizowanych biokatalizatorów:
- preparaty pojedynczych enzymów katalizujących proste reakcje biochemiczne
- kompleksy 2 lub więcej enzymów (reakcje złożone)
- całe komórki bez zachowania ich funkcji życiowych
- żywe komórki z zachowaniem i wykorzystaniem ich aktywności metabolicznej.

Kryteria wyboru techniki immobilizacji żywych komórek:
- metoda immobilizacji powinna być wystarczająco łagodna, by zapewnić zdolność do regeneracji komórek
- proces powinien zapewnić regenerację złoża podczas długiego czasu działania bioreaktora
- technika immobilizacji powinna zapewnić osiągnięcie w bioreaktorze wysokiej koncentracji biomasy
i utrzymywanie jej na równym poziomie przez wydłużony okres działania
- technika ta powinna być prosta i realtywnie tania
- system im mobilizowanych komórek powinien być trwały w danych warunkach pH i temperatury.

Pożądane cechy nośnika do immobilizacji komórek:
- neutralność wobec mikroorganizmu i środowiska
- odporność mechaniczna na działające w bioreaktorze:

•

siły ściskania(ciśnienie hydrostatyczne)

•

siły ścinające (podczas mieszania)

- odporność na atak mikrobiologiczny
- odporność na czynniki fizyczne, np. temperaturę
- odporność na czynniki chemiczne, np. kwasy, zasady, rozpuszczalniki organiczne, inhibitory, toksyny.

Metody immobilizacji

Wiązanie na powierzchni nośnika:

•

Adsorpcja i adhezja dzięki siłom jonowym, wiązaniom wodorowym i innym oddziaływaniom

fizykochemicznym. Adsorpcja do podłoża związana jest z oddziaływaniem sił Van der Waalsa i potencjału zeta
(powierzchniowy ładunek elektrostatyczny wynikający z rozdziału grup COOH i NH

na powierzchni komórki:

adsorpcja następuje w wyniku odmienności ładunku komórki i nośnika. Adhezja komórek do ciał stałych
związana jest z naturalną właściwością mikroorganizmów, dzięki której mogą one tworzyć filmy biologiczne;
jest to zakodowana genetycznie zdolność do wytwarzania substancji klejących i cementujących (najczęściej
polisacharydów). Największymi zaletami tej metody są niskie koszty używanych materiałów i łatwość
wykonania. Wady: metoda mało uniwersalna, wiązanie z nośnikiem słabe i wrażliwe na zmiany warunków
ś

rodowiska, np. pH, siły jonowej, temperatury. Na stopień i siłę adhezji duży wpływ ma rodzaj użytych

mikroorganizmów oraz porowatość nośników. W metodach tych stosuje się nośniki organiczne, np.: węgiel,
antracyt, sephadeks, drewno i in. oraz nieorganiczne: szkło, spieki szklane, cegła, ziemia okrzemkowa, materiały
ceramiczne, kaolin, tlenki metali i inne.

•

Wiązania kowalencyjne takie jak peptydowe, estrowe, węgiel-węgiel, węgiel-azot i inne pomiędzy np.

aktywnymi grupami ściany komórkowej a uaktywnionym nośnikiem. W wiązaniu chemicznym wykorzystuje się
wiązania kowalencyjne wprowadzając do środowiska wielofunkcyjne czynniki sprzęgające (aldehydy, aminy),
które znacznie ograniczają stosowanie tej metody ze względu na swoją toksyczność. Stosuje się nośniki
silikonowe i ceramiczne.

Wiązanie w matrycy nośnika:

Metoda ta polega na otaczaniu komórek przez usieciowaną membranę lub matrycę polimerową. Jednym
z podstawowych kryteriów jest dobór takiego nośnika, którego wielkość porów jest mniejsza od średnicy
komórki, ale na tyle duża by substrat mógł penetrować do komórki. Jest to najpowszechniej stosowana metoda
immobilizacji, zwłaszcza w przemyśle spożywczymi fermentacyjnym.
System ten można realizować następującymi metodami:

•

pułapkowanie w żelach naturalnych lub syntetycznych – przykłady nośników: agar, alginian, karagen,

poliakrylamid, poliuretan, polistyren. Wiązanie w matrycy może następować poprzez powstawanie
poprzecznych wiązań jonowych w polimerach liniowych np. alginianu w obecności kationów poliwalentnych
(Ca

, Al

, Ba, Sr

). Związanie biokatalizatora z nosnikiem można uzyskać poprzez wytrącanie nośnika na

skutek zmian temperatury, pH lub zmianami rozpuszczalnika (żelatyna, karaginian).

•

pułapkowanie na włóknach – jest odmianą żelowania przez wytrącanie, lecz stosuje się tu polimery

tworzące włókna, co daje bardziej rozwiniętą powierzchnię nośnika.

Zamykanie wewnątrz membran półprzepuszczalnych:

•

zamykanie w komórkach naturalnych, np. erytrocytach

•

kapsułkowanie i mikrokapsułkowanie: kapsułki alginianowe, liposomy, kapsułki nylonowe,

polimocznikowe, z pochodnych celulozy. Metoda ta polega na sporządzeniu emulsji biokatalizatora w
odpowiednim medium. Taką emulsję rozpyla się w specjalnym roztworze wywołującym powstawanie otoczki
wokół biokatalizatora, która selektywnie przepuszcza substraty i produkty

•

zamykanie pomiędzy membranami lub w wężach półprzepuszczalnych.

Unieruchamianie bez makroskopowego nośnika mechanicznego:

•

sieciowanie przestrzenne, kopolimeryzacja enzymów z nośnikami rozpuszczalnymi przy użyciu

odczynników dwufunkcyjnych

•

flokulacja komórek przy udziale – o wydajności tej metody decydują właściwości ściany komórkowej

•

samoregulacja, czyli naturalna flokulacja oraz wzrost drobnoustrojów w postaci kuleczek lub kłaczków

biomasy.

Przyczyny zmniejszania produktywności złoża:
1.

Wymywanie enzymu lub komórek ze złoża, rozpuszczanie lub ścieranie się złoża.

Utrata aktywności na skutek zatruwania lub denaturacji enzymu bądź lizy komórek.

Pogorszenie się warunków kontaktu substratu z enzymem w wyniku zanieczyszczenia i zatkania się

złoża oraz zmiany charakterystyki przepływu roztworu substratu.
4.

Zakażenia mikrobiologiczne.

Zastosowanie immobilizacji:
W przemyśle farmaceutycznym:
- produkcja antybiotyków – ponad 60 % światowej produkcji kwasu 6-aminopenicylinowego (6-APA), z którego
metodami chemicznymi lub enzymatycznymi otrzymuje się 16 różnych antybiotyków lak tamowych,
otrzymywanych jest przy zastosowaniu im mobilizowanych biokatalizatorów;
- produkcja hormonów i witamin;
- inne leki.
Produkcja aminokwasów:
- kwas asparaginowy – transformacja Dumaranu do asparginianu poprzez komórki E. coli immobilizowane
w karaginianie, produkcja: L-alaniny, kwasu L-glutaminowego, L-argininy.
W przemyśle spożywczym:
- produkcja alkoholu etylowego, octu, usuwanie laktozy z mleka, hydroliza kazeiny, skrobii, białek, produkcja
witaminy B

, syropu fruktozowego, klarowanie win i soków.

W preparatyce i ochronie środowiska:
- produkcja aktywnych białek, peptydów,
- wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych,
- w ochronie środowiska (oczyszczanie ścieków).

WYKONANIE ĆWICZENIA

Sprzęt i odczynniki:

- 200 mM CaCl

- 0,7 % i 6 alginian sodu,
- 6 skrobia rozpuszczalna,
- zawiesina komórek Saccharomyces cerevisiae,
- Kolbki Erlenmayera, zlewki, krystalizatory, pipety,
- kulki szklane i ceramiczne,
- strzykawka, lejek do immobilizacji,
- mieszadło magnetyczne,

Zadanie 1. Unieruchomienie komórek drożdży w alginianie

Wymieszać 6 % roztwór alginianu z zawiesiną komórek drożdżowych w proporcji 1:1, aż do uzyskania

homogennej zawiesiny. Umieścić roztwór CaCl

wraz z elementem mieszającym na mieszadle magnetycznym i

wkraplać do niego przy użyciu strzykawki lub specjalnego lejka do immobilizacji, mieszaninę alginian-komórki
drożdżowe.

Pozostawić utworzone kulki w roztworze CaCl

na ok. 5-10 min. celem ich utwardzenia.

Zadanie 2. Unieruchomienie komórek w kapsułkach alginiuanowych.

Komórki zawiesić w 6 % roztworze skrobii rozpuszczalnej. Tak przygotowaną mieszaninę wkraplać

strzykawką do mieszającego się 0,7 % roztworu alginianu sodu.

Utworzone kapsułki przenieść do roztworu utwardzającego – 200 mM roztwór CaCl

i łagodnie

mieszać przez około 10 min.

METODY HODOWLI

DROBNOUSTROJÓW

CEL ĆWICZENIA

Zapoznanie się z metodami hodowli drobnoustrojów, ich

zastosowaniem oraz sposobami monitorowania ich przebiegu

PODZIAŁ HODOWLI ZE WZGLĘDU NA
KONSYSTENCJĘ STOSOWANYCH POśYWEK
HODOWLANYCH

•

hodowle na podłożach płynnych

•

hodowle na podłożach stałych

METODY HODOWLI DROBNOUSTROJÓW

•

hodowle okresowe

•

hodowle ciągłe

•

hodowle ciągłe z recyrkulacją komórek (hodowle
modyfikowane)

•

hodowle okresowo-dolewowe (hodowle z zasilaniem)

2.1.

HODOWLE OKRESOWE

Najprostsza i najczęściej stosowana metoda hodowli.
Hodowle prowadzone do momentu wyczerpania się składników
pokarmowych w podłożu lub nagromadzenia się w nim metabolitów
toksycznych dla mikroorganizmów.

2.2.

HODOWLE CIĄGŁE

Hodowle prowadzone z ciągłym dozowaniem świeżej pożywki
i jednoczesnym odprowadzaniem pożywki zużytej z analogiczną
szybkością (hodowle prowadzone przy stałej objętości płynu
hodowlanego)

•

T,UVT!WX!.!

TY,łYT[

;

UVNV]X!

^_$

•

stan równowagi dynamicznej ustala się, gdy: D = n

ZALETY HODOWLI CIĄGYCH

•

wyeliminowanie wpływu czasu hodowli na zmiany
warunków hodowli i fizjologię komórek

•

duża wydajność bioprocesorów

•

dobre wykorzystanie sprzętu stosowanego do hodowli

•

możliwość automatyzacji

WADY HODOWLI CIĄGŁYCH

•

możliwość mutacji i degradacji szczepów

•

trudność utrzymania warunków aseptycznych

•

możliwość zmiany warunków hodowli
(agregacja drobnoustrojów, obrastanie przewodów)

ZASTOSOWANIE HODOWLI CIĄGŁYCH

•

produkcja etanolu, kwasu mlekowego, kwasu octowego

•

produkcja biomasy (bakterii, drożdży i glonów)
wykorzystywanej następnie do otrzymywania kultur
starterowych lub jako źródło białka

•

oczyszczanie ścieków metodą osadu czynnego

2.3.

HODOWLE CIĄGŁE Z RECYRKULACJĄ KOMÓREK
(HODOWLE MODYFIKOWANE)

•

hodowle z zastosowaniem technik dializacyjnych oraz technik
mikro i ultra filtracyjnych

•

hodowle o wysokiej koncentracji komórek

•

hodowle z ciągłym dozowaniem świeżej pożywki i
jednoczesnym odbieraniem permeatu zawierającego toksyny
lub labilny produkt

2.4.

HODOWLE OKRESOWO-DOLEWOWE

•

hodowle z okresowym wprowadzaniem świeżej pożywki lub
niektórych jej składników (FBC)

•

hodowle z cyklicznym odbieraniem części hodowli (RFBC)

•

hodowle z okresowym odbieraniem części płynu
hodowlanego i uzupełnianiem go świeżym podłożem

ZASTOSOWANIE HODOWLI

OKRESOWO-DOLEWOWYCH

•

produkcja alkoholi, kwasów organicznych, antybiotyków,
aminokwasów, witamin, alkaloidów

•

produkcja białka jednokomórkowców

ZADANIA DO WYKONANIA

•

OZNACZENIE LICZBY śYWYCH KOMÓREK
W INOKULACIE

•

obliczenie ilości inokulatu potrzebnego do uzyskania
początkowego stężenia komórek 10

jkt/ml

•

OZNACZENIE ZAWARTOŚCI GLUKOZY W POśYWCE
I PŁYNIE HODOWLANYM

•

obliczenie stopnia odfermentowania glukozy

•

OZNACZENIE STĘśENIA BIOMASY

•

BILANSE MATERIAŁOWE HODOWLI CIĄGŁYCH

OZNACZENIE LICZBY śYWYCH KOMÓREK

W INOKULACIE

↓

24-godzinny inokulat bakterii Lb. acidophilus

↓

Rozcieńczenie 10-krotnie w wodzie destylowanej

(0,1 ml zawiesiny bakterii + 0,9 ml wody)

dokładne wymieszanie roztworu

↓

naniesienie kropli rozcieńczonej zawiesiny bakterii w miejsce

krzyżujących się linii komory Thoma

↓

przykrycie szkiełkiem nakrywkowym

↓

policzenie komórek znajdujących się w 30 losowo wybranych

kwadratach (obiektyw 40x)

↓

obliczenie średniej liczby komórek występujących w 1 kwadracie (a)

OBLICZENIE CAŁKOWITEJ LICZBY śYWYCH KOMÓREK

W INOKULACIE

` 4 · 10

· P · I

X – całkowita liczba komórek w 1 ml inokulatu
a – średnia liczba komórek w 1 kwadracie
b – rozcieńczenie próby

OBLICZENIE ILOŚCI INOKULATU POTRZEBNEGO DO

UZYSKANIA POCZĄTKOWEGO STĘśENIA KOMÓREK

JTK/ML

objętość płynu w bioreaktorze wynosi 3000 ml

w 1 jego ml ma być 10

jtk

czyli w 3000 ml musi być 3

⋅

jtk

1 ml inokulatu mamy – (wartość obliczona)

X – 3

⋅

jtk

63-7·c·6

3efg7

T!U2Vść VN-]XV.! 3efg7

OZNACZANIE ZAWARTOŚCI GLUKOZY

W POśYWCE I PŁYNIE HODOWLANYM

KOLORYMETRYCZNĄ METODĄ MULLERA

pobranie 10 ml płynu hodowlanego z bioreaktora

↓

wirowanie 10 min przy 5,5 tys obr./min

↓

zlanie superantantu do probówki

↓

pobranie 0,5 ml superantantu + 0,5 ml DNS-u

↓

ogrzewanie 5 min superantantu we wrzącej łaźni wodnej

↓

schłodzenie w strumieniu wody + 5 ml wody destylowanej

↓

pomiar ekstynkcji przy długości fali 530 nm za pomocą

spektrofotometru

OBLICZENIE ZAWARTOŚCI GLUKOZY

W POśYWCE I PŁYNIE HODOWLANYM

Zależność pomiędzy ekstynkcją (y),

a zawartością glukozy w badanych płynach (x)

opisuje równanie

O 1/2

OBLICZENIE STOPNIA ODFERMENTOWANIA FLUKOZY

Znając zawartość glukozy w pożywce (100 %) oraz zawartość glukozy

w pobranym płynie (x %) oblicz stopień jej odfermentowania

OZNACZENIE STĘśENIA BIOMASY

pobranie 10 ml płynu hodowlanego z bioreaktora

↓

wirowanie 10 min przy 5,5 tys obr./min

↓

zlanie superantantu do probówki

(do oznaczenia zawartości glukozy)

↓

zawieszenie biomasy w 10 ml wody destylowanej

(przemycie biomasy)

↓

wirowanie 5 min przy 5,5 tys obr./min

↓

zawieszenie biomasy w 10 ml wody destylowanej

dokładne wymieszanie

↓

pomiar transmitacji światła przechodzącego przez próby przy długości

fali 600 nm

BILANSE MATERIAŁOWE HODOWLI CIĄGŁYCH

SZYBKOŚĆ ROZCIEŃCZANIA – D [1/h]

klmĘokŚĆ rkŻtuRv urwku<xykz{m 3

}

klmĘokŚĆ rkŻtuRv u z<~ytzv kxku<zt 'klm.wklk~y<(3-7

TECHNOLOGIE KOMPOSTOWANIA.

•

kompostowanie w warunkach naturalnych (w pryzmach na otwartym powietrzu)

•

kompostowanie w warunkach sztucznych (w komorach, na płytach fermentacyjnych, w brykietach) ze
wstępną obróbką odpadów.

Innym ostatnio stosowanym podziałem technologii kompostowania jest podział na:

•

kompostowanie odpadów zmieszanych

•

kompostowanie wydzielonej frakcji odpadów organicznych.

WYKORZYSTANIE ODPADÓW KOMUNALNYCH W POLSCE

W 1996 r. usunięto 46,45 mln m

stałych odpadów komunalnych, co stanowi 55 % ogólnej masy

wytwarzanych odpadów. Wykorzystanie odpadów komunalnych jest niewielkie i sprowadza się do:

wytwarzania kompostu (218,6 tys ton odpadów poddano kompostowaniu),

wykorzystania do celów energetycznych gazu wysypiskowego (produkcja energii elektrycznej),

wyselekcjonowania w systemie zbiórki i segregacji składników o charakterze surowców wtórnych:

•

papier, makulatura,

•

opakowania szklane, stłuczka szklana,

•

metale żelazne i nieżelazne,

•

tworzywa sztuczne.

rednio w kraju wykorzystanie składników wyselekcjonowanych z odpadów komunalnych nie przekracza 0,5 %

ogólnej masy usuwanych odpadów.

MATERIAŁ WYKORZYSTYWANY DO PRODUKCJI KOMPOSTU.

Surowiec do przygotowania kompostu powinien zawierać odpowiednio dużą ilość substancji organicznej, która
musi być większa niż 30 %, dostateczną ilość azotu, a także brak związków toksycznych.

Do kompostowania stosuje się:

•

odpady komunalne

Zawierają 35-50 % składników organicznych. Pozostałą część masy stanowią różnorodne odpady

mineralne i tworzywa sztuczne. Szacuje się, że w odpadach komunalnych znajduje się ok. 1 mln ton
suchej masy organicznej, która może być kompostowana. Zawiera ona średnio ok. 1,5 % azotu.

•

masa roślinna z terenów zieleni miejskiej, rekreacyjnej i przemysłowej
Zieleń miejska i osiedlowa zajmuje ok. 65000 ha na terenie całego kraju. Przyjmując 5 ton rocznej
produkcji masy roślinnej z hektara otrzymujemy ok. 325 tys. ton surowca o zawartości ok. 1,5 % azotu.

•

odpady z zakładów przetwórstwa rolno-spożywczego

•

odpady z zakładów produkcji drewna i wyrobów

•

osady z biologicznego oczyszczania ścieków

Głównymi źródłami osadów ściekowych są oczyszczalnie ścieków miejskich. Chemiczne

właściwości osadów z tych oczyszczalni są zbliżone do osadów z miejskich oczyszczalni ścieków.
Do nawożenia gleb najkorzystniejsze są osady ze ścieków przemysłu rolno-spożywczego. Osady stanowią ok. 1-
2 % oczyszczanych ścieków. Wymagają one obróbki: zagęszczenia, stabilizacji i odwodnienia. Przeciętna
zawartość azotu w osadach wynosi ok. 3 %. Mają one wyjątkowo korzystną zawartość koloidalnej substancji
organicznej i składników pokarmowych dla roślin. Do tych wad zaliczamy nadmierną koncentrację składników
szkodliwych dla środowiska, w tym głównie metali ciężkich, ponadnormatywną obecność chorobotwórczych
organizmów, płynną, mazistą konsystencję, uciążliwość zapachową.

WARUNKI KOMPOSTOWANIA

•

odpowiedni skład chemiczny materiału wyjściowego

•

odpowiedni stosunek węgla organicznego do azotu (C:N) – materiał wyjściowy C:N=17-30:1, gotowy
kompost C:N=20-30:1.

•

temperatura – pryzma zagrzewa się do 60-70

Utrzymywanie tej temperatury przez kilka dni gwarantuje pełną higienizację kompostu

i zniszczenie organizmów chorobotwórczych.

•

wilgotność – optymalny poziom zwilgocenia masy kompostowej wynosi 40-50%,

•

utrzymywanie odpowiedniego pH (6,5-7,5),

•

napowietrznienie

•

rozdrobnienie materiału

PODSTAWOWE OPERACJE TECHNOLOGICZNE

Ważenie i rejestracja (z archiwizacją) dowożonych odpadów z terenu miasta na składowisko.

Hala przyjęć i segregacji odpadów na platformę przyjęć oraz ich załadunek za pomocą ładowarki
kołowej na taśmę linii segregacji. Segregacja mechaniczna w sicie i ręczna z podziałem na strumienie,

•

odpady mineralne o frakcji do 20 mm, kierowane na składowisko odpadów,

•

odpady o frakcji 20-100 mm, głównie odpady organiczne przeznaczone do kompostowania,

•

odpady o frakcji powyżej 100 mm, głównie odpady surowcowe i balastowe, kierowane są na
sortowniczą segregacji pozytywnej i negatywnej skąd dalej na składowisko.

Zagęszczenie na prasie wysegregowanych odpadów nieorganicznych bale o wymiarach 80x100 cm do
składowania. Rozdrabnianie wysegregowanych odpadów organicznych. Mieszanie wysegregowanych odpadów
organicznych z osadami ściekowymi.
Zagospodarowanie wysegregowanych strumieni odpadów:

•

surowce wtórne (szkło, metale) – układem przenośników taśmowych kierowane są do kontenerów
i dalej okresowo wywożone do zagospodarowania na rynku surowcowym,

•

odpady niebezpieczne ze strumienia odpadów organicznych (baterie, lekarstwa, farby, opakowania po
ś

rodkach chemicznych) – układem przenośników taśmowych kierowane są do kontenerów i dalej

okresowo wywożone do zagospodarowania na rynku surowcowym,

•

części organiczne ze strumienia o frakcji powyżej 100 mm – dotyczy przede wszystkim mokrych
kartonów i opakowań papierowych z zawartością części organicznej – części organiczne kierowane są
na linię odpadów organicznych, przeznaczonych do kompostowania.

Kompostowanie wysegregowanych i rozdrobnionych odpadów organicznych.

Wysegregowane odpady organiczne po rozdrobnieniu i zmieszaniu z osadami ściekowymi przewiezione
z oddziału za pomocą ładowarki kołowej do miejsca kompostowania pod wiatą. Miejsce to wyposażone jest
w instalację do nawadniania i napowietrzania (metodą rurową) pryzm oraz odwodnienia (zbierania
i odprowadzania odcieków). Odpady formowane są w pryzmy kompostowe o podstawie ok. 6m, wysokości
2,8 m i długości 65 m. Tak uformowane odpady podlegają procesowi kompostowania przez okres ok. 4-
6 tygodni. Ogółem jest 10 linii pryzmowych, w tym 2 rezerwowe na za i wyładunek kompostowni. Pojemność
1 linii pryzmowej odpowiada tygodniowemu przerobowi odpadów organicznych.

Obróbka (uszlachetnianie) kompostu.

•

sortowanie frakcyjne kompostu na sicie bębnowym o prześwicie 22 mm,

•

oczyszczanie mechaniczne kompostu na stole balistycznym z zanieczyszczeń mineralnych tzw.
Twardych sprężystych (szkło, kamienie, ceramikę, metale, itp.),

•

oczyszczanie kompostu z zanieczyszczeń nieorganicznych lotnych (tworzyw sztucznych i folii
opakowaniowych) metodą pneumatyczną w cyklonie.

•

odsiew i wydzielone zanieczyszczenia w procesie uszlachetniania kierowane są na linię odpadów
nieorganicznych przed prasą i dalej na kwatery składowania odpadów.

Tymczasowe składowanie i dojrzewanie gotowego kompostu.

sprasowanych w bele odpadów organicznych oraz wysegregowanych odpadów mineralnych drobnych
w kwaterze ziemnej: odpady są formowane w warstwy o wysokości 2 m, każda 2 m warstwa odpadów
przesypywana jest warstwą izolacyjną o grubości 0,2 m. Warstwę izolacyjną stanowią odpady mineralne
o frakcji do 20 mm i inne odpady mineralne oraz masy ziemne pozostałe z robót ziemnych przy budowie
kwatery.

ENZYMY Z GRUPY OKSYDO-REDUKTAZ

DYSMUTAZY NADTLENKOWE

Posiadają w swoich centrach jako grupy prostetyczne aktywne jony: żelaza, manganu, niklu lub miedzi + cynku
(są metaloproteinami). Najszerzej spotykane są dysmutazy zawierające żelazo lub mangan.
Mn-dysmutazy: Propioniobacterium sp, Thermus thermophilus.
Fe-dysmutazy: Propioniobacterium sp., Mycobacterium vaccae, E. coli, Pseudomonas ovalis.

Występują powszechnie u mikroorganizmów tlenowych.
Rozkładają anionowe rodniki ponadtlenkowe do tlenu cząsteczkowego i nadtlenku wodoru i w ten sposób
chronią organizmy przed niszczącym działaniem rodników ponadtlenkowych.

Co to jest rodnik?

To atomy lub cząsteczki posiadające na zewnętrznej orbicie pojedynczy elektron. Dążąc do przyłączenia lub
oddania elektrony wykazują dużą aktywność chemiczną utleniając każdy związek, z którym mają kontakt.
Preferowanym obiektem „ataku” rodników są związki zawierające podwójne wiązanie. U organizmów żywych
system ten jest zabójczy – skuteczną obronę stanowi glutation.

Toksyczne rodniki ponadtlenkowe tworzą się w czasie cyklu redukcji chinonu

].V.

WY[2!X!

YWUV].V.

redukcja

YWUV].V.

-!!X!

].V.

UVW.

utlenianie

].V.

WY[2!X!

].V.

UVW.

utlenianie

Uwolnione rodniki ponadtlenkowe działają, jako czynniki redukujące lub utleniające i w ten sposób biorą udział
w rozkładzie ligniny, np. przez rozcinanie pierścieni, demetylację, itp. System ten rozkłada wiele innych
związków aromatycznych.

Rodnik ponadtlenkowy może działać, jako czynnik utleniający, tworzący wysoko reaktywny jon Mn

•

+ Mn

+ 2H

→

+ H

lub, jako czynnik redukujący żelazo z uwolnieniem tlenu cząsteczkowego:

•

+ Fe

→

+ Fe

Dalej, 2-wartościowe jony żelaza wchodzą w reakcję z nadtlenkiem wodoru i tworzą ekstremalnie reaktywne
rodniki hydroksylowe:

+ H

→

+ HO

•

+ OH

(reakcja Fentona)

Rodniki ponadtlenkowe mogą także tworzyć rodniki hydroksylowe:

•

+ H

→

•

+ OH

+ O

(reakcja Hober-Weisa)

Rodniki ponadtlenkowe w połączeniu z dużą ilością uwalnianego tlenu oraz wespół z rodnikami
hydroksylowymi tworzą system OKSYDO-REDUKUJĄCY rozkładający wiele związków pierścieniowych.
System ten jest jednak zabójczy dla organizmów żywych, dlatego produkują one dysmutazy w celu neutralizacji
tych rodników:

WY[2!X!

Ogólnie zostało zaakceptowane, iż u wszystkich dysmutaz jon metalu (M) katalizuje reakcję dysmutacji
rodników ponadtlenkowych na drodze cyklicznego mechanizmu redukcyjno-utleniającego:

Usuwanie nadtlenku wodoru przeprowadza katalaza:

!2!-!X!

BC 3

PEROKSYDAZY

Są to enzymy katalizujące utlenianie nadtlenkiem wodoru różnych substratów, w tym
aromatycznych. W reakcji dochodzi do redukcji nadtlenków. Peroksydazy zawierają w swojej cząsteczce Fe, Mn
lub Se. Najpierw tworzony jest kompleks żelaza z wodą a następnie utlenianie donatora wodoru AH

produktu A. Donatorami wodoru mogą być łańcuchy alifatyczne:

O) + H

→

) + H

) + AH

→

(OH) + AH + H

AH + Fe

(OH)

→

O) + A

Do najbardziej znanych enzymów z tej grupy należy peroksydaza glutationowa, odkryta w 1970 r. Jest to enzym
zależny od selenu, gdyż selen, jako jedyna grupa prostetyczna, wchodzi w skład centrum aktywnego w formie
selenocysteiny. Enzym ten ma 4 identyczne podjednostki.

Peroksydaza ligninowa (Fe) katalizuje wiele reakcji utleniania w alkilowym łańcuchu bocznym związków
ligninowych. Do utleniania potrzebuje nadtlenku wodoru. Rozrywa wiązania C

-C

w łańcuchach bocznych,

wiązania eterowe i utlenia benzylowe grupy alkoholowe do ketonów lub aldehydów. Przy utlenianiu ligniny
peroksydaza współdziała z alkoholem weretrylowym.

OKSYDAZA CYTOCHROMOWA

Enzym z grupy oksydaz zawierający Fe i Cu, używający tlen, jako akceptor wodoru. Stanowi ostatnie ogniwo
łańcucha oddechowego. Znana jest pod nazwami kompleks cytochrom a i cytochrom a

. Występuje u wszystkich

organizmów tlenowych.

MONOOKSYGENAZY
Katalizują wbudowanie jednego atomu cząsteczkowego tlenu do substratu, podczas gdy 2 jest redukowany do
wody.

DIOKSYGENAZY

Katalizują wbudowanie 2 atomów cząsteczkowego tlenu (z atmosfery) do substratu. Substratami są często
katechol i kwas protokatechinowy. Przy wbudowaniu tlenu do cząsteczki zostaje rozerwany pierścień
aromatyczny. W ten sposób następuje rozerwanie pierścieni benzenowych, katecholowych i innych.

LAKKAZA

Jest oksydoreduktazą. Produkują ją grzyby, szczególnie tzw. „białej zgnilizny drewna”. Katalizuje utlenianie
takich monofenoli jak fenol, tyrozyna, naftol i krezol oraz utlenia difenole a także kwas indoliooctowy
i askorbinowy. Fenole zawierające dłuższe łańcuchy boczne są lepszymi substratami. Kompleksy:

Enzym-Cu

+AH

Enzym-Cu

+ (AH

)

Enzym-Cu

+ Cu

+ O

+ H

Enzym-Cu

+ H

– substrat; (AH

)

- substrat utleniony

CHARAKTERYSTYKA ODPADÓW KOMUNALNYCH

•

odpady domowe

•

odpady z obiektów użyteczności publicznej

•

odpady z terenów zieleni

•

nieg i lód

•

urobek ziemny

•

gruz

•

odpady gospodarczo-bytowe

PORÓWNANIE METOD KOMPOSTOWANIA

ZALETY

WADY

PRYZMY

•

elastyczna zmiana przepustowości

•

proste urządzenia

•

pracochłonne, produkujące zapachy

•

bardzo duża powierzchnia terenu

kontakt operatora z pryzmami

STOS NAPOWIETRZANY

•

elastyczna zmiana przepustowości

•

proste urządzenia

•

pracochłonne, produkujące zapachy

•

bardzo duża powierzchnia terenu

kontakt operatora z pryzmami

REAKTOR MIESZANY

•

pełne natlenienie mieszaniny

•

pełne wymieszanie kompostu

•

przyjmuje różne materiały strukturotwórcze

•

stała objętość, brak elastyczności

•

większa powierzchnia terenu

•

kontakt operatora z pryzmami

REAKTOR BEZTLENOWY

•

nie musi być intensywnie mieszany

•

przyjmuje różne materiały strukturotwórcze

odzysk biogazu

•

konieczność tlenowego dojrzewania

KLASY KOMPOSTU DOJRZAŁEGO WEDŁUG NORMY BN-89/9103-09

OZNACZENIA

JEDNOSTKA

MASY

j. m.

KLASA I

KLASA II

KLASA III

1. CECHY CHEMICZNE:

ZAWARTOŚĆ NIE MNIEJ NIś

Zawartość substancji

organicznej

% s. m.

Zawartość azotu

ogólnego

% s. m.

0,8

0,6

0,3

Zawartość potasu

% s. m.

0,2

0,1

Zawartość fosforu

% s. m.

0,6

0,4

0,3

Zawartość wody

25-40

Odczyn (pH w H

6,5-8,0

6,0-9,0

2. ZAWARTOŚĆ METALI CIĘśKICH

ZAWARTOŚĆ NIE WIĘCEJ NIś

MIEDŹ Cu

mg/kg s. m.

300

600

800

CYNK Zn

mg/kg s. m.

1500

2500

NIKIEL Ni

mg/kg s. m.

100

200

CHROM Cr

mg/kg s. m.

300

500

800

OŁÓW Pb

mg/kg s. m.

350

500

800

KADM Cd

mg/kg s. m.

ROZKŁAD MATERII ORGANICZNEJ I SYNTEZY PRÓCHNICY

Technologia kompostowania metodą „Brikollare”

KOMPOSTOWNIA SYSTEMU ROZDRABNIARKOWEGO [Skaranowski, 1999]

Przenośnik stalowo-członowy

Przesiewacz wstępny

Rozdrabniarka młotkowa

Separator elektromagnetyczny

Mieszalnik homogenizujący z sitem bębnowym

Przerzucarka kompostu

Instalacja napowietrzania pryzm kompostowych

Filtr kompostowy

Przesiewacz wibracyjny

10.

Odsiewacz cząsteczek twardych

KOMPOSTOWNIA SYSTEMU DANO [Skaranowski, 1999]

Przenośnik płytowy

Przenośnik taśmowy odpadów

Biostabilizator

Przenośnik taśmowy balastu

Przenośnik

taśmowy

kompostu

Przenośnik taśmowy balastu

Sito wibracyjne

10.

Przenośnik

taśmowy

kompostu

11.

Oddzielacz części twardych

12.

Oddzielacz
elektromagnetyczny

13.

Sito bębnowe

14.

Przenośnik

taśmowy

kompostu dojrzałego

15.

Pojemnik na złom żelazny

16.

Pojemnik na złom żelazny

17.

Pojemnik na części twarde

18.

Przenośnik

taśmowy

kompostu uszlachetnionego

19.

Pojemnik na odsiewy

20.

Przenośnik

taśmowy

kompostu surowego

21.

Wentylator wyciągowy gazów

KOMPOSTOWNIA SYSTEMU HERHOFF [Skaranowski, 1999]

KOMPOSTOWNIA MOBILNA (ORGANIC 90) [Jurasz, 1998]

Kompostownik – Organic 90; 2. Rozdrabniarka; 3. Ładowarka

KONTENEROWE URZĄDZENIE DO KOMPOSTOWANIA – SCHEMAT TECHNOLOGII HORTSMANN

[Jurasz, 1998]

BADANIE CZYSTOŚCI MIKROBIOLOGICZNEJ WODY PITNEJ I POWIETRZA

Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest oznaczenie stanu sanitarno-biologicznego wody pitnej i powietrza.

Zadania do wykonania

Oznaczyć czystość mikrobiologiczną wody pitnej metodą tradycyjną oraz metodą filtrów
membranowych

Metoda tradycyjna

Wodę pobierz do jałowej kolby, a następnie dodaj do niej kroplę roztworu tiosiarczanu sodu niezbędnego
do inaktywacji chloru. W celu określenia czystości mikrobiologicznej z badanej wody wykonaj posiewy
w kierunku:

•

ogólnej liczby bakterii mezofilnych – posiew na agar odżywczy

Jałową pipetą pobierz 1ml badanej wody i przenieś na 2 równoległe płytki Petriego. Płytki zalej następnie
upłynnionym podłożem agarowym (agarem odżywczym, bulionem odżywczym lub bulionem wzbogaconym)
i inkubuj w temperaturze 37

C przez 24-48 h. Posiewy wykonuj bezpośrednio z pobranej wody lub po jej

rozcieńczeniu zależnie od przewidywanego stopnia jej zakwaszenia (po konsultacji z prowadzącym ćwiczenia).

•

ogólnej liczby bakterii psychrofilnych – posiew na agar odżywczy

Posiew wykonaj w analogiczny sposób jak posiew mający na celu oznaczenie ogólnej liczby bakterii
mezofilnych. Posiane płytki inkubuj w temp. 20

C przez 72 h.

•

obecności bakterii z grupy coli ogólnego – posiew na podłoże z LBP, tj. podłoże laktozowe z purpurą
bromokreaolową

W celu oznaczenia obecność bakterii z grupy coli posiej 100 ml wody na podwójne stężone podłoże aLBP –
50 ml wody do kolbki zawierającej 50 ml podłoża i po 10ml do 5 probówek z 10 ml pożywki LBP. Zaszczepione
próby inkubuj w temp. 37

C przez 24-48 h.

Metoda filtrów membranowych

Zmontuj aparat do filtracji. Za pomocą jałowej pęsety przenieś specjalny filterek na porowatą powierzchnię filtra
zestawu filtracyjnego. Zamocuj lejek, a następnie przeprowadź filtrację wody w celu oznaczenia:

•

ogólnej liczby bakterii mezofilnych

Do lejka wlej ok. 100ml jałowej wody i 1ml wody badanej. Włącz pompkę układu filtracyjnego. Po zakończeniu
filtracji wyłącz ja i przenieś filtr na przygotowaną płytkę (Perti-Pad) zalaną uprzednio podłożem pozwalającym
na oznaczenie ogólnej liczby bakterii, płytki inkubuj w pozycji odwróconej w temp. 37

C przez 24-48 h.

•

ogólnej liczby bakterii psychrofilnych – posiew na agar odżywczy

Posiew wykonaj w analogiczny sposób jak posiew mający na celu oznaczenie ogólnej liczby bakterii
mezofilnych. Posiane płytki inkubuj w temp. 20

C przez 72 h.

•

ogólnej liczby bakterii z grupy coli

Filtracji poddaj 100 ml badanej wody. Filterki umieść na płytce zawierającej podłoże Endo i inkubuj je w temp.
37

C przez 24-48 h.

•

ogólnej liczby bakterii coli typu fekalnego

Filtracji poddaj 100ml badanej wody. Filterki umieść na płytce zawierającej podłoże MF i inkubuj je w temp.
44

C przez 24-48 h.

•

ogólnej liczby bakterii z rodzaju Streptococus

Filtracji poddaj 100 ml badanej wody. Filterki umieść na płytce selektywnej na streptokoki i inkubuj je w temp.
37

C przez 24-48 h.

Oznaczyć czystość mikrobiologiczną powietrza metodą tradycyjną oraz z zastosowaniem
próbnika powietrza.

Metoda tradycyjna czyli sedymentacyjna metoda Kocha (metoda płytkowa)

W celu określenia stanu sanitarno-higienicznego powietrza w wybranym miejscu pomieszczenia ustaw 2 płytki
z agarem odżywczym i 1 płytkę z brzeczką + agar. Zdejmij wieczka z płytek i pozostaw je na 15 min. W trakcie
ekspozycji ogranicz ruchy wokół miejsca z ustawionymi płytkami. Płytki zamknij i inkubuj w temperaturze:

•

C przez 72 h – płytka z agarem odżywczym (ogólna liczba bakterii psychrofilnych)

•

C przez 24-48 h – płytka z agarem odżywczym (ogólna liczba bakterii mezofilnych)

•

C przez 72 h – płytka z brzeczką (ogólna liczba drożdży i pleśni).

Metoda z zastosowaniem próbnika powietrza

Próbniki powietrza to specjalnie skonstruowane aparaty do kontroli jakości mikrobiologicznej powietrza.
Aparaty te są wyposażone w czujniki przepływu powietrza, które zapewniają pobór określonej ilości powietrza
gwarantując tym samym powtarzalność wyników. W próbnikach zamontowuje się specjalne płytki z zestalonym
podłożem – bulionem do oznaczenia ogólnej liczby bakterii oraz z brzeczką służącą do oznaczania ogólnej
liczby drożdży i pleśni.
Ustaw aparat na pobór 100 l powietrza. Metalową pokrywkę próbnika przetrzyj alkoholem. Zdejmij wieczko ze
specjalnej płytki i umieść ją w próbniku. Przykręć pokrywkę i włącz aparat. Po przepuszczeniu 100 l powietrza
wyjmij płytkę i zamknij ją.
W celu określenia stanu sanitarno-biologicznego powietrza dokonaj analogicznych posiewów jak w metodzie
tradycyjnej czyli 2 posiewów na płytki z agarem odżywczym (zestalonym bulionem) oraz 1 posiewu na płytkę
z brzeczką + agar. Po wykonaniu płytki inkubuj w temperaturze:

•

C przez 72 h – płytka z agarem odżywczym (ogólna liczba bakterii psychrofilnych)

•

C przez 24-48 h – płytka z agarem odżywczym (ogólna liczba bakterii mezofilnych)

•

C przez 72 h – płytka z brzeczką (ogólna liczba drożdży i pleśni).

ZADANIA

Oblicz parametry K

i V

max

30 min reakcji enzymatycznej hydrolizy skrobi w stężeniach 0,2; 0,4; 0,6;

0,8 i 1,0 % w wyniku której otrzymano produkt końcowy (glukozę) w następujących odpowiednich dla
stężeń substratu ilościach: 0,7; 1,0; 1,3; 1,7 i 1,94 [mg/ml].

Mając dane równania prostych regresji zależności odwrotności szybkości przebiegu reakcji od stężenia
substratu:

y = 0,05x + 0,025
y = 0,066x + 0,02
wyciągnij wnioski o rodzaju inhibicji.

3.

Podaj model kinetyczny reakcji wykorzystania laktozy przez bakterie Escherischia coli rosnących na
pożywkach zawierających laktozę w ilości 10; 5; 2,5 i 1 g/l. Szybkość wykorzystania tego cukru
wynosiła odpowiednio 2,5; 2; 1,5 i 1 g/l

⋅

h. Oblicz przewidywaną szybkość wykorzystania laktozy,

przy początkowym jej stężeniu 1,5 g/l.

Wyznacz parametry K

i V

max

oraz określ typ inhibicji aktywności alkalicznej fosfatazy przez fosforany,

mając do dyspozycji następujące dane:

Stężenia substratu

[A] x 10

Szybkość reakcji

Szybkość reakcji z inhibitorem

5,85
4,76
3,51
2,34
1,17

0,833
0,800
0,763
0,667
0,500

0,488
0,425
0,345
0,274
0,159

Oblicz jaka ilość inokulum jest niezbędna do zaszczepienia 3l pożywek hodowlanych aby po inokulacji

w ich w każdym ml było 10

komórek.

Wiedząc, że szybkość rozcieńczenia to stosunek V pożywki doprowadzanej do reakcji do V pożywki

wypełniającej bioreaktor oblicz, jaka powinna być szybkość dodania pożywki maltozy wprowadzonej do
bioreaktora z 3 l pożywki hodowlanej w ciągu 5 h, aby szybkość rozcieńczenia wynosiła 0,05 l/h.

szybkość = x/3 l
x = 0,09

⋅

x = 0,45 [l]
x = 450 [ml]
x

⋅

5 h = ilość pożywki

Oblicz, jaką V świeżej pożywki należy wprowadzić do bioreaktora w ciągu 1 h, aby po 20 h hodowli

wymienić całą V roboczą bioreaktora (5 l pożywki) oraz wyznacz szybkość rozcieńczania.

X – 1 h
5 l – 20 h
x = 0,25 l = 250 ml
V = 250/5000 = 0,05 [h

-1

]

Ile ml inokulum o c = 4,3

⋅

należy dodać do 3000 ml aby uzyskać 10

komórek?

4,3

⋅

– 3000

⋅

– x

x = 3:4,3 = 0,7
W 1 ml ma być 10

, czyli w 3000 musi być 3

⋅

1 ml (inokulatu – c.obl)
x – 3

⋅

x = (3

⋅

1 ml)/zawartość obliczeniowa

Mając daną gęstość komórek w kulturze macierzystej wynoszącą 2x10

kom/ml oblicz, jaka ilość

inokulum jest niezbędna do zaszczepienia 3 l pożywki hodowlanej w bioreaktorze, aby po inokulacji w każdym
jej ml było 10

komórek.

3000

⋅

= 3x10

kom

⋅

kom – 1ml

⋅

– x ml

x = 15 ml – trzeba przenieść do bioreaktora

Szybkość rozcieńczania D [1/h]

D = obj. pożywki wprowadzanej do reaktora [ml/h]/ obj. pożywki w naczyniu hodowlanym [ml]

Wiedząc, że szybkość rozcieńczania to stosunek objętości pożywki doprowadzanej do reaktora do obj. pożywki
wypełniającej bioreaktor, oblicz jaką ilość pożywki należy wprowadzić do bioreaktora z 3 l pożywki hodowlanej
w ciągu 5 h, aby szybkość rozcieńczania wynosiła 0,03 h

-1

0,03

c37

X = 90 [ml/h]
CZYLI
X⋅5h 90 · 5 450 3ml7

10.

Oblicz, jaką objętość świeżej pożywki należy wprowadzić do bioreaktora w ciągu 1 h, aby po 20 h

hodowli wymienić całą objętość roboczą bioreaktora – 5 l płynu hodowlanego oraz wyznacz szybkość
rozcieńczania.

5000 ml – 20 h
x – 1 h
x = 250 ml/h

D = 250 [ml/h]/5000 [ml] = 0,05 [l/h]

Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
trusek hołownia, procesy membranowe, PROCESY MEMBRANOWE w przemyśle spożywczym
TERMOMETRY, INŻYNIERIA PROCESOWA, Aparatura procesowa, Aparatura przemysłu spożywczego
masz WYKŁAD 4. G, INŻYNIERIA PROCESOWA, Aparatura procesowa, Aparatura przemysłu spożywczego
suszenie, uniwersytet warmińsko-mazurski, inżynieria chemiczna i procesowa, rok III semestr 6, apara
aparatura sprawko, uniwersytet warmińsko-mazurski, inżynieria chemiczna i procesowa, rok III semestr
płytowy wymiennik ciepła, uniwersytet warmińsko-mazurski, inżynieria chemiczna i procesowa, rok III
pompy, uniwersytet warmińsko-mazurski, inżynieria chemiczna i procesowa, rok III semestr 6, aparatur
Złożony proces produkcji żywności w przemyśle spożywczym
operator urzadzen przemyslu spozywczego 827[01] z2 02 u
operator urzadzen przemyslu spozywczego 827[01] o1 04 n
Woda technologiczna do produkcji piwa, Ekologia, Gospodarka odpadami, Energetyka, Gospodarka wodno-
Ćw 3 Destylacja i rektyfikacja w przemyśle spożywczym, Studia, Jakość, OTŻ, OTŻ, Destylacja i rektyf
operator urzadzen przemyslu spozywczego 827[01] o1 01 u

więcej podobnych podstron