2011/2012

Agnieszka Sapa
Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej

Strona 1 z 5

Chemia kliniczna
Dla studentów IV roku Analityki Medycznej

Wdrażanie metody analitycznej

Kalibracja analizy

Agnieszka Sapa

Katedra Analityki Medycznej

Zakład Chemii Klinicznej

Chemia kliniczna

dla studentów IV roku Analityki Medycznej

Rodzaje metod:



Jakościowe – wynik typu „dodatni” „ujemny”



Półilościowe – skala nasilenia reakcji np. na 2+, 3+



Ilościowe – wynik w postaci liczby przedstawiającej stężenie,
aktywnośd



Rodzaje metod ilościowych



rutynowa



referencyjna



definitywna

Nowa

metoda –

dlaczego?

Wybór metody

– jakie

kryteria?

Ustalenie

pożądanej

jakości metody –

wybór TEA

Kalibracja analizy

Walidacja metody

Formuła

wyniku

Wartości

decyzyjne/

przedziały

referencyjne

Sposób

kontroli

jakości

Nareszcie -

wydajemy

wyniki!

Bieżąca kontrola i

dokumentacja

metody

Wdrażanie metody

Wynik

badania

Błąd dopuszczalny wyniku

– TEA (ang. Total Error Allowable)



Tradycyjnie: jest to możliwa do zaakceptowania różnica
pomiędzy uzyskanym wynikiem a wartością rzeczywistą
wielkości mierzonej.



Określa pożądaną jakośd analityczną metody



Jeśli nasze błędy pomiarowe go nie przekraczają –
uznajemy, że nasze wyniki są wiarygodne



Dla każdego parametru/każdej metody może byd inny!

Wyznaczanie błędu dopuszczalnego:



Reguła Tonks’a (1963 r.)



Obliczanie na podstawie współczynników zmienności
biologicznej



Analiza opinii klinicystów



Publikowane zalecenia ekspertów krajowych lub
międzynarodowych w zakresie diagnostyki lab. (np. NACB,
IFCC, CLIA) lub konkretnych dziedzin klinicznych (np. NCEP,
ESC, PTD)



Określony przez obowiązujące przepisy



W oparciu o wyniki międzylaboratoryjnej oceny jakości
(COBJwDL, PPZOJMED)



Wartości wynikające z aktualnych możliwości technicznych
tzw. state of the art

Reguła Tonks’a

TEA =

x 100 %



Problem pojęcia „norma”



Można stosowad modyfikacje (np. 1/8, 1/10)



Obecnie stosowana rzadko

¼ zakresu normy

średnia z zakresu normy

2011/2012

Agnieszka Sapa
Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej

Strona 2 z 5

Chemia kliniczna
Dla studentów IV roku Analityki Medycznej

Kryterium zmienności biologicznej

Dopuszczalna nieprecyzyjnośd

I

A



0,5 CV

w

Dopuszczalne obciążenie

B

A



0,25



CV

2

g

+ CV

2

g

CV

w

within-subject biologic variation – wsp. zmienności dla zmienności

biologicznej wewnątrzosobniczej – dane z fachowego piśmiennictwa

CV

g

between-subject biologic variation – wsp. zmienności dla zmienności

biologicznej międzyosobniczej – dane z fachowego piśmiennictwa



Na TEA składa się dopuszczalna nieprecyzyjnośd i dopuszczalne

obciążenie



Polecam: http://www.westgard.com/biodatabase1.htm

Kto dokonuje wyboru TEA?



W Polsce – kierownik laboratorium lub wyznaczona przez
niego osoba odpowiedzialna za sprawy jakości



W innych krajach np. USA, Niemcy – ustalany
zewnętrznie, przez upoważnione organizacje.



Jakie są skutki przyjęcie zbyt małego/dużego TEA?



Możliwośd modyfikacji

Magiczne słowo – walidacja



według PN-EN ISO/IEC 17025:

„walidację definiuje się jako potwierdzenie, przez

zbadanie i przedstawienie obiektywnego dowodu, że
zostały spełnione szczególne wymagania dotyczące
konkretnie zamierzonego zastosowania”



Wymagania dot. walidacji zawarte w normach
technicznych dla laboratoriów:



PN-EN ISO/IEC 17025



PN/EN ISO 15189 – szczególne wymagania dla laboratoriów
medycznych

„kompromis między kosztami, ryzykiem

i możliwościami technicznymi”

Walidacja obejmuje więc:



Specyfikację wymagao stawianych metodzie



Określenie jej cech charakterystycznych



Sprawdzenie, czy wymagania mogą zostad spełnione



Stwierdzenie o przydatności metody



Dotyczy nie tylko samej metody!



Również pobierania, transportu i przygotowania próbek

W toku walidacji określa się:



Zakres roboczy



Liniowośd



Czułośd



Granicę detekcji (wykrywalności) i granicę oznaczenia
ilościowego



Selektywnośd/specyficznośd, podatnośd na interferencje



Precyzję (powtarzalnośd, odtwarzalnośd, warunki
pośrednie)



Poprawnośd i obciążenie



Dokładnośd (jako niepewnośd pomiaru)



Oraz dodatkowo – koszt i czas badania

Charakterystyka procedur badawczych



Cel badania



Zasada metody



Rodzaj materiału badanego i wpływ czynników
przedanalitycznych



Wymagane wyposażenie i odczynniki



Procedury kalibracyjne (z określoną spójnością pomiarową)



Procedury kontroli jakości



Interferencje, reakcje krzyżowe



Przedział referencyjny/wartości decyzyjne



Interpretacja wyników

Na podstawie PN/EN ISO 15189

2011/2012

Agnieszka Sapa
Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej

Strona 3 z 5

Chemia kliniczna
Dla studentów IV roku Analityki Medycznej

Cechy metody:



Wykrywalnośd



Czułośd



Selektywnośd/Specyficznośd



Podatnośd na interferencje



Liniowośd



Precyzja



Poprawnośd

Czułośd



Najmniejsza ilośd substancji jaką można oznaczyd daną
metodą



Najmniejsza różnica stężeo jaką można wykryd daną
metodą

Wykrywalnośd



Najmniejsza ilośd substancji jaką można wykryd daną
metodą

Selektywnośd/specyficznośd



Zdolnośd metody do wykrywania tylko jednej określonej
substancji w złożonej mieszaninie bez zakłóceo ze strony
innych składników mieszaniny



Metoda idealnie selektywna oznaczania danego składnika
jest metodą specyficzną

Podatnośd na interferencje



Lipemia (surowica lipemiczna)



Hemoliza



Bilirubina (surowica ikteryczna)



Inne

Liniowośd metody



Jest to zakres stężeo, w którym jest spełnione prawo
Lamberta-Beera



W skrócie: absorbancja roztworu substancji zależy
wprostproporcjonalnie od jej stężenia (stężenia barwnego
produktu reakcji)



Wyrażona współczynnikiem korelacji, który nie powinien
byd mniejszy niż 0.999

Kalibracja analizy



Wzorzec – ważny punkt kalibracji analizy



Rodzaje wzorców:



Wzorzec chemiczny



Wzorzec kliniczny I-go rodzaju



Wzorzec kliniczny II-go rodzaju



Kalibrator – materiał przenoszący dokładnośd

Od prawidłowego wzorca zależy:



Stabilnośd kalibracji wewnątrz laboratorium



Poprawny punkt wyjścia do wdrożenia metody



Jednolitośd kalibracji między laboratoriami



Wzorzec (materiał referencyjny)

– element standaryzacji

2011/2012

Agnieszka Sapa
Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej

Strona 4 z 5

Chemia kliniczna
Dla studentów IV roku Analityki Medycznej

Wykres kalibracyjny



Sporządzenie roztworów wzorcowych obejmujących zakres
stężeo spodziewanych w materiale biologicznym.



Przeprowadzenie reakcji zgodnie z procedurą metody w
dwóch albo trzech powtórzeniach dla każdego stężenia
wzorca.



Wykreślenie natężenia sygnału (absorbancja, fluorescencja
itp.) w funkcji stężenia wzorca w układzie współrzędnych.

Absorbancja y

y

1

x

1

x

Stężenie



b

y = ax + b

a = tg α
b – wyraz wolny

Obliczanie równania prostej regresji



Prostą regresji wyznacza się najczęściej metodą
najmniejszych kwadratów.



Aby określid stopieo powiązania dwóch zmiennych
oblicza się współczynnik korelacji (r), określa on siłę
(wartośd r) i kierunek związku (+/–) i może
przyjmowad wartości od –1 do 1.

Typy krzywych wzorcowych



Ustalenie typu krzywej jest istotne



Częstośd wykonywania ponownej kalibracji zależy od tego,
czy krzywa jest powtarzalna, czy niepowtarzalna



W metodach automatycznych często korzysta się z
zaleceo producenta*

* Producent chce przede wszystkim jak najwięcej zarobid – wskazany jest

zdrowy rozsądek i rzetelna wiedza diagnosty laboratoryjnego 

Krzywa powtarzalna



Jeśli na etapie wdrażania metody ustalimy, że krzywa
jest powtarzalna, kolejne kalibracje będą
wykonywane tylko w przypadku awarii metody, o ile
analiza przyczyn złych wyników w materiałach
kontrolnych nasunie nam podejrzenie, że problemem
jest kalibracja



Kalibrację powinno się wykonywad jak najrzadziej

Krzywa niepowtarzalna



Kalibracja metody jest konieczna w każdym postępowaniu
analitycznym (w każdej serii pomiarowej)



Od kształtu krzywej zależy liczba punktów ponownej
kalibracji



Prostoliniowa – zwykle 1 punkt (często w metodach
manualnych)



Nieprostoliniowa – wielopunktowa (np. ELISA)

2011/2012

Agnieszka Sapa
Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej

Strona 5 z 5

Chemia kliniczna
Dla studentów IV roku Analityki Medycznej

Typy krzywych wzorcowych



Krzywa prostoliniowa:



powtarzalna,



niepowtarzalna



Krzywa nieprostoliniowa:



powtarzalna,



niepowtarzalna

Zadanie na dziś – objętośd koocowa 1000 µl

Stężenie roztworu

wzorcowego

[mg/dl]

Objętośd wzorca o stężeniu

500 mg/dl

[μl]

Objętośd wody

[μl]

A teraz coś gratis…

Podstawowe zasady pracy z pipetami
automatycznymi



Nie wolno pobierad cieczy bez założonej koocówki



Należy zawsze sprawdzid, czy koocówka jest dobrze
nałożona



Nie wolno odwracad pipety z mokrą koocówką!!!



Naciąganie cieczy do koocówki – trzymamy pipetę
pionowo



Wydawanie cieczy z koocówki – trzymamy pipetę
pionowo, probówkę pod kątem ok. 45





Podczas pobierania nie powinno się zanurzad koocówki w
cieczy głębiej niż na ok. 3-5 mm



Nie wolno gwałtownie puszczad tłoka – ciecz może
przedostad się do trzonu pipety i ją uszkodzid



Nie powinno się pipetowad odczynników „prosto z
lodówki”, z pewnymi wyjątkami (np. biologia molekularna,
małe objętości, odczynniki wrażliwe na temperaturę)



Pobieranie i wydawanie cieczy z pipety powinno trwad kilka
sekund, szczególnie przy pipetowaniu większych objętości

Okresowy przegląd, konserwacja i kalibracja pipet

– personel fachowy 

Sposoby pipetowania



I – wciskamy tłok pipety do pierwszego oporu, pobieramy
ciecz, wydajemy do drugiego oporu



II – pipetowanie cieczy bardzo lepkich, pieniących się –
wciskamy tłok pipety do drugiego oporu, pobieramy ciecz,
wydajemy do pierwszego oporu