Transferazy

Transferazy

-

-

transaminazy

transaminazy

(

(

aminotransferaza

aminotransferaza

alaninowa i

alaninowa i

asparaginowa)

asparaginowa)

E.C.2.6.1.2.

E.C.2.6.1.2.

Aminotransferaza

Aminotransferaza

alaninowa (ALT)

alaninowa (ALT)

Cel

Cel

ć

ć

wicze

wicze

ń

ń

:

:

Ocena aktywno

Ocena aktywno

ś

ś

ci enzymu wska

ci enzymu wska

ź

ź

nikowego

nikowego

jakim jest

jakim jest

aminotransferaza

aminotransferaza

asparaginianowa

asparaginianowa

w osoczu krwi kr

w osoczu krwi kr

ó

ó

w zdrowych i chorych

w zdrowych i chorych

Wyst

Wyst

ę

ę

powanie:

powanie:

Wewn

Wewn

ą

ą

trzkom

trzkom

ó

ó

rkowy enzym

rkowy enzym

zlokalizowany w cytoplazmie.

zlokalizowany w cytoplazmie.

•

•

Osocze

Osocze

•

•

W

W

ą

ą

troba

troba

•

•

Serce

Serce

•

•

Mi

Mi

ęś

ęś

nie

nie

Mechanizm dzia

Mechanizm dzia

ł

ł

ania:

ania:

Odwracalna reakcja przeniesienia grupy

Odwracalna reakcja przeniesienia grupy

aminowej z alaniny na

aminowej z alaniny na

ketokwas

ketokwas

(alfa

(alfa

-

-

ketoglutaran

ketoglutaran

) przy udziale PLP.

) przy udziale PLP.

Oznaczanie aktywno

Oznaczanie aktywno

ś

ś

ci:

ci:

•

•

Oparte jest na r

Oparte jest na r

ó

ó

ż

ż

nicy

nicy

absorbancji

absorbancji

2,4

2,4

-

-

dwunitrofenylohydrazon

dwunitrofenylohydrazon

ó

ó

w kwasu

w kwasu

alfa

alfa

-

-

ketoglutarowego

ketoglutarowego

i pirogronowego w

i pirogronowego w

ś

ś

rodowisku zasadowym

rodowisku zasadowym

Znaczenie kliniczne:

Znaczenie kliniczne:

Enzym wska

Enzym wska

ź

ź

nikowy charakterystyczny

nikowy charakterystyczny

dla schorze

dla schorze

ń

ń

w

w

ą

ą

troby (zapalenia,

troby (zapalenia,

marsko

marsko

ść

ść

,

,

ż

ż

ó

ó

ł

ł

taczki) oraz uszkodzenia

taczki) oraz uszkodzenia

mi

mi

ęś

ęś

ni szkieletowych (zmia

ni szkieletowych (zmia

ż

ż

d

d

ż

ż

enia,

enia,

zaniki). W ich przebiegu stwierdza si

zaniki). W ich przebiegu stwierdza si

ę

ę

klinicznie znacz

klinicznie znacz

ą

ą

ce zwi

ce zwi

ę

ę

kszenie

kszenie

aktywno

aktywno

ś

ś

ci ALT w surowicy.

ci ALT w surowicy.

E.C.2.6.1.1.

E.C.2.6.1.1.

Aminotransferaza

Aminotransferaza

asparaginianowa

asparaginianowa

(AST)

(AST)

Wyst

Wyst

ę

ę

powanie:

powanie:

Wewn

Wewn

ą

ą

trzkom

trzkom

ó

ó

rkowy enzym

rkowy enzym

zlokalizowany w

zlokalizowany w

mitochondrium

mitochondrium

oraz

oraz

cytozolu

cytozolu

.

.

•

•

Serce

Serce

•

•

W

W

ą

ą

troba

troba

•

•

Mi

Mi

ęś

ęś

nie

nie

Mechanizm dzia

Mechanizm dzia

ł

ł

ania:

ania:

Odwracalna reakcja przeniesienia

Odwracalna reakcja przeniesienia

grupy aminowej z

grupy aminowej z

asparaginianu

asparaginianu

na

na

alfa

alfa

-

-

ketoglutaran

ketoglutaran

przy udziale PLP.

przy udziale PLP.

Oznaczanie aktywno

Oznaczanie aktywno

ś

ś

ci:

ci:

•

•

Oparte jest na r

Oparte jest na r

ó

ó

ż

ż

nicy

nicy

absorbancji

absorbancji

2,4

2,4

-

-

dwunitrofenylohydrazon

dwunitrofenylohydrazon

ó

ó

w kwasu

w kwasu

alfa

alfa

-

-

ketoglutarowego

ketoglutarowego

i pirogronowego w

i pirogronowego w

ś

ś

rodowisku zasadowym

rodowisku zasadowym

Znaczenie kliniczne:

Znaczenie kliniczne:

Enzym wska

Enzym wska

ź

ź

nikowy charakterystyczny

nikowy charakterystyczny

dla schorze

dla schorze

ń

ń

mi

mi

ęś

ęś

nia sercowego (zawa

nia sercowego (zawa

ł

ł

y,

y,

zapalenia), w

zapalenia), w

ą

ą

troby (zapalenia, marsko

troby (zapalenia, marsko

ść

ść

,

,

ż

ż

ó

ó

ł

ł

taczki) oraz uszkodzenia mi

taczki) oraz uszkodzenia mi

ęś

ęś

ni

ni

szkieletowych (zmia

szkieletowych (zmia

ż

ż

d

d

ż

ż

enia, zaniki). W

enia, zaniki). W

ich przebiegu stwierdza si

ich przebiegu stwierdza si

ę

ę

klinicznie

klinicznie

znacz

znacz

ą

ą

ce zwi

ce zwi

ę

ę

kszenie aktywno

kszenie aktywno

ś

ś

ci AST w

ci AST w

surowicy.

surowicy.

Transaminacja

Transaminacja

Aminotransferaza

Aminotransferaza

(

(

transaminaza

transaminaza

) alaninowa

) alaninowa

(ALT, ALAT, GPT)

(ALT, ALAT, GPT)

Aktywno

Aktywno

ść

ść

ALT w surowicy (U/l)

ALT w surowicy (U/l)

22

22

-

-

128

128

25

25

-

-

60

60

31

31

-

-

53

53

20

20

-

-

107

107

3

3

-

-

50

50

Chomiki

Chomiki

syryjskie

syryjskie

Ś

Ś

winki

winki

morskie

morskie

Kr

Kr

ó

ó

liki

liki

Koty

Koty

Psy

Psy

9

9

-

-

43

43

23

23

-

-

44

44

5

5

-

-

17

17

25

25

-

-

74

74

3

3

-

-

25

25

Ś

Ś

winie

winie

Kozy

Kozy

Owce

Owce

Byd

Byd

ł

ł

o

o

Konie

Konie

Wzrost aktywno

Wzrost aktywno

ś

ś

ci od warto

ci od warto

ś

ś

ci

ci

referencyjnej do 200 U/l

referencyjnej do 200 U/l

Nowotwory w

Nowotwory w

ą

ą

troby.

troby.

Zapalenie trzustki.

Zapalenie trzustki.

Hemoliza

Hemoliza

in

in

vitro

vitro

i

i

in

in

vivo.

vivo.

Wzrost aktywno

Wzrost aktywno

ś

ś

ci od 200 U/l do 400 U/l

ci od 200 U/l do 400 U/l

Cholestazy

Cholestazy

w

w

ą

ą

trobowe.

trobowe.

Marsko

Marsko

ść

ść

w

w

ą

ą

troby (jednocze

troby (jednocze

ś

ś

nie

nie

podwy

podwy

ż

ż

szenie warto

szenie warto

ś

ś

ci AST)

ci AST)

Leczenie du

Leczenie du

ż

ż

ymi dawkami salicylan

ymi dawkami salicylan

ó

ó

w.

w.

Wzrost aktywno

Wzrost aktywno

ś

ś

ci od 200 U/l do 4000 U/l

ci od 200 U/l do 4000 U/l

Wirusowe zapalenie w

Wirusowe zapalenie w

ą

ą

troby.

troby.

Toksyczne uszkodzenie w

Toksyczne uszkodzenie w

ą

ą

troby.

troby.

Niewydolno

Niewydolno

ść

ść

kr

kr

ąż

ąż

enia.

enia.

Podane s

Podane s

ą

ą

warto

warto

ś

ś

ci referencyjne dla metody

ci referencyjne dla metody

optymalizowanej w temperaturze 37

optymalizowanej w temperaturze 37

°

°

C.

C.

Aktywno

Aktywno

ś

ś

c

c

ALT w

ALT w

metodach

metodach

nieoptymalizowanych

nieoptymalizowanych

jest o 30% ni

jest o 30% ni

ż

ż

sza.

sza.

Hemoliza powoduje zawy

Hemoliza powoduje zawy

ż

ż

enie wynik

enie wynik

ó

ó

w. W surowicy

w. W surowicy

przechowywanej temperaturze 4

przechowywanej temperaturze 4

°

°

C, po 3 dniach nast

C, po 3 dniach nast

ę

ę

puje

puje

spadek aktywno

spadek aktywno

ś

ś

ci enzymu o 10%, natomiast w

ci enzymu o 10%, natomiast w

temperaturze

temperaturze

-

-

20

20

°

°

C surowica mo

C surowica mo

ż

ż

e by

e by

ć

ć

przechowywana do

przechowywana do

7 dni bez istotnych zmian.

7 dni bez istotnych zmian.

Pojawienie si

Pojawienie si

ę

ę

podwy

podwy

ż

ż

szonych aktywno

szonych aktywno

ś

ś

ci ALT w surowicy

ci ALT w surowicy

wskazuje raczej na rozleg

wskazuje raczej na rozleg

ł

ł

e uszkodzenie kom

e uszkodzenie kom

ó

ó

rek, a nie na

rek, a nie na

zaburzenia funkcji narz

zaburzenia funkcji narz

ą

ą

du.

du.

U ps

U ps

ó

ó

w ras: doberman,

w ras: doberman,

Bedington

Bedington

terier,

terier,

West

West

highland

highland

white

white

terier podwy

terier podwy

ż

ż

szony poziom ALAT mo

szony poziom ALAT mo

ż

ż

e sugerowa

e sugerowa

ć

ć

chorob

chorob

ę

ę

spichrzeniow

spichrzeniow

ą

ą

Cu (

Cu (

copper

copper

storage

storage

disease

disease

).

).

Aminotransferaza

Aminotransferaza

(

(

transaminaza

transaminaza

)

)

asparaginianowa

asparaginianowa

(AST,

(AST,

AspAT

AspAT

, GOT)

, GOT)

Aktywno

Aktywno

ść

ść

AST w surowicy (U/l)

AST w surowicy (U/l)

28

28

-

-

122

122

27

27

-

-

68

68

42

42

-

-

98

98

6

6

-

-

44

44

1

1

-

-

37

37

Chomiki

Chomiki

syryjskie

syryjskie

Ś

Ś

winki

winki

morskie

morskie

Kr

Kr

ó

ó

liki

liki

Koty

Koty

Psy

Psy

16

16

-

-

65

65

122

122

-

-

321

321

40

40

-

-

96

96

58

58

-

-

100

100

205

205

-

-

555

555

Ś

Ś

winie

winie

Kozy

Kozy

Owce

Owce

Byd

Byd

ł

ł

o

o

Konie

Konie

Wzrost aktywno

Wzrost aktywno

ś

ś

ci od warto

ci od warto

ś

ś

ci

ci

referencyjnej do 200 U/l

referencyjnej do 200 U/l

(z wyj

(z wyj

ą

ą

tkiem koni i k

tkiem koni i k

ó

ó

z)

z)

Marsko

Marsko

ść

ść

w

w

ą

ą

troby.

troby.

Zapalenie trzustki.

Zapalenie trzustki.

Hemoliza

Hemoliza

in

in

vitro

vitro

i

i

in

in

vivo.

vivo.

Wzrost aktywno

Wzrost aktywno

ś

ś

ci od 200 U/l do 400 U/l

ci od 200 U/l do 400 U/l

Choroby mi

Choroby mi

ęś

ęś

ni szkieletowych.

ni szkieletowych.

Przewlek

Przewlek

ł

ł

e zapalenie w

e zapalenie w

ą

ą

troby.

troby.

Zabiegi chirurgiczne.

Zabiegi chirurgiczne.

Paso

Paso

ż

ż

yty.

yty.

Niedob

Niedob

ó

ó

r selenu i witaminy E.

r selenu i witaminy E.

Wzrost aktywno

Wzrost aktywno

ś

ś

ci od 200 U/l do 4000 U/l

ci od 200 U/l do 4000 U/l

Zawa

Zawa

ł

ł

mi

mi

ęś

ęś

nia sercowego.

nia sercowego.

Wirusowe zapalenie w

Wirusowe zapalenie w

ą

ą

troby.

troby.

Toksyczne uszkodzenie w

Toksyczne uszkodzenie w

ą

ą

troby.

troby.

Nowotwory.

Nowotwory.

Intensywny wysi

Intensywny wysi

ł

ł

ek u koni sportowych.

ek u koni sportowych.

Podane s

Podane s

ą

ą

warto

warto

ś

ś

ci referencyjne dla metody

ci referencyjne dla metody

optymalizowanej w temperaturze 37

optymalizowanej w temperaturze 37

°

°

C. Aktywno

C. Aktywno

ść

ść

AST w

AST w

metodach optymalizowanych jest jednakowa w surowicy i

metodach optymalizowanych jest jednakowa w surowicy i

osoczu. Hemoliza powoduje zawy

osoczu. Hemoliza powoduje zawy

ż

ż

enie wynik

enie wynik

ó

ó

w.

w.

Pojawienie si

Pojawienie si

ę

ę

podwy

podwy

ż

ż

szonych aktywno

szonych aktywno

ś

ś

ci AST w surowicy

ci AST w surowicy

analogicznie do ALT wskazuje raczej na rozleg

analogicznie do ALT wskazuje raczej na rozleg

ł

ł

e

e

uszkodzenie kom

uszkodzenie kom

ó

ó

rek, a nie na zaburzenia funkcji narz

rek, a nie na zaburzenia funkcji narz

ą

ą

du.

du.

W diagnostyce niekt

W diagnostyce niekt

ó

ó

rych schorze

rych schorze

ń

ń

ps

ps

ó

ó

w pomocny jest wska

w pomocny jest wska

ź

ź

nik de

nik de

Ritisa

Ritisa

, opisuj

, opisuj

ą

ą

cy stosunek AST

cy stosunek AST

do ALT, kt

do ALT, kt

ó

ó

rego warto

rego warto

ść

ść

prawid

prawid

ł

ł

owa mie

owa mie

ś

ś

ci si

ci si

ę

ę

w granicach od 1,2 do 1,8.

w granicach od 1,2 do 1,8.

Zadanie 1

Zadanie 1

Metoda oznaczania aktywności AST i ALT oparta jest na różnicy

absorbancji 2,4-dwunitrofenylohydrazonów kwasu alfa oksoglutarowego i
pirogronowego w środowisku zasadowym. W wyniku reakcji katalizowanej
przez AST powstaje kwas szczawiooctowy, który ulega samoistnej
dekarboksylacji i tworzy się z 2,4-dwunitrofenylohydrazyną (DNFH) także
hydrazon kwasu pirogronowego.

Miarą aktywności aminotransferaz jest zatem przyrost stężenia kwasu

pirogronowego w probówkach inkubowanych z surowicą w porównaniu z
probówkami kontrolnymi.

Reakcje katalizowane przez aminotransferazy:

ALT

alanina : 2-oksoglutaran ⇒

pirogronian : glutaminian

AST

aparaginian : 2-oksoglutaran ⇒

szczawiooctan : glutaminian

Zadanie 1

Zadanie 1

Wykonanie.

Do 4 probówek: 1 (AST kontr.), 2 (AST bad.), 3 (ALT kontr.) i 4 (ALT

bad.) dodawać wymienione w poniżej zamieszczonej tabeli odczynniki i
surowicę oraz wykonywać opisanie w niej czynności.

Po up

Po up

ł

ł

ywie 10 min. zmierzy

ywie 10 min. zmierzy

ć

ć

warto

warto

ść

ść

absorbancji

absorbancji

pr

pr

ó

ó

b badanych wobec odpowiednich pr

b badanych wobec odpowiednich pr

ó

ó

b kontrolnych przy

b kontrolnych przy

d

d

ł

ł

ugo

ugo

ś

ś

ci fali 505 nm, nast

ci fali 505 nm, nast

ę

ę

pnie odczyta

pnie odczyta

ć

ć

liczb

liczb

ę

ę

jednostek aktywno

jednostek aktywno

ś

ś

ci z krzywych wzorcowych

ci z krzywych wzorcowych

5

5

5

5

5

5

5

5

0,4 mol/dm

0,4 mol/dm

3

3

NaOH

NaOH

pozostawi

pozostawi

ć

ć

w temp. pokojowej

w temp. pokojowej

na 20 min.

na 20 min.

pozostawi

pozostawi

ć

ć

w temp. pokojowej

w temp. pokojowej

na 20 min.

na 20 min.

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

DNFH

DNFH

60 min. w

60 min. w

ł

ł

a

a

ź

ź

ni wodnej w temp. 37

ni wodnej w temp. 37

o

o

C

C

30 min. w

30 min. w

ł

ł

a

a

ź

ź

ni wodnej w temp. 37

ni wodnej w temp. 37

o

o

C

C

Inkubacja

Inkubacja

0,1

0,1

-

-

0,1

0,1

-

-

Surowica ko

Surowica ko

ń

ń

ska

ska

5 min.

5 min.

5 min.

5 min.

Inkubacja w

Inkubacja w

ł

ł

a

a

ź

ź

ni wodnej w

ni wodnej w

temp. 37

temp. 37

°

°

C

C

0,5

0,5

-

-

0,5

0,5

0,1

0,1

0,5

0,5

-

-

0,5

0,5

0,1

0,1

Substrat

Substrat

Roztw

Roztw

ó

ó

r

r

NaCl

NaCl

0,9%

0,9%

Badana

Badana

Kontrola

Kontrola

Badana

Badana

Kontrola

Kontrola

ALT

ALT

AST

AST

Odczynniki

Odczynniki