Aparatura HPLC

Informacje ogólne

Obecnie najważniejsze firmy produkujące chromatografy cieczowe oferują aparaty o

bardzo zbliżonej konstrukcji podstawowych modułów. Różnice polegają na jakości ma-
teriałów, jakości wykonania, zakresu możliwości funkcjonalnych oprogramowania i
wygody jego użytkowania, ale także niekiedy zakresu wyposażenia aparatu w detektory
różnego typu, a niekiedy także różne są własności użytkowe oferowanych detektorów.
Warto zwrócić uwagę, czy producent aparatury legitymuje się certyfikatem systemu
zapewnienia jakości w/g normy ISO 9001.
Najważniejsze moduły chromatografu cieczowego:
A) Aparat typu izokratycznego (stały skład eluenta)

B) Aparat typu gradientowego (programowanie składu zmian eluenta albo stały skład).
Różnica dotyczy tylko modułów 1 i 2. z rys. 1 (poniżej), tzn. system zasilania kolumny
eluentem. Systemy zasilania występują w aparatach różnego typu i różnej ceny w
dwóch opcjach:
a) z zastosowaniem zaworów proporcjonujących (2-4 zawory proporcjonujące) po

stronie ssącej pompy – opcja tańsza, lecz ma wady,

b) z zastosowaniem dwóch do czterech równolegle pracujących pomp o wzajemnie

zmienianej wydajności.

Znaczenie symboli na rys. 1- 3:

1, 1’, 1”, 1”’ – Butelka z eluentem lub składnikiem eluenta (A, B, C, D) albo specjalny

pojemnik eluenta z systemem odgazowania eluenta helem.

F

- filtr cieczy ze spieku porowatego.

2, 2’ - Pompa

na

preparatyw

ml

kolumnowa

ml

klasyczna

ml

min

/

100

1

min

/

0

,

1

01

,

0

"

"

min

/

10

1

,

0

−

−

−

⎪⎩

⎪

⎨

⎧

μ

3 (D) - zawór dozujący albo autosampler
Ko

- kolumna ochronna

(5) K - kolumna właściwa separacyjna
4

- komora termostatyczna

6

- detektor lub szeregowo połączone detektory

7

- integrator lub komputerowy system rejestracji i przetwarzania danych oraz ste-

rownik aparatu

8

- mikser (mieszalnik) statyczny lub dynamiczny

PK

- prekolumna; w celu nasycenia eluenta fazą stacjonarną, dla zabezpieczenia

właściwej kolumny przed „zdzieraniem” fazy stacjonarnej

Najważniejsze parametry i informacje na temat modułów składowych apa-
ratury chromatograficznej HPLC.

1. Pompy

Najczęściej tłokowe typu ssąco-tłoczącego jednogłowicowe, dwutłokowe: z jed-
nym tłokiem pracującycm jako pompa (zawory ssąco-tłoczące szafir, rubin) i z
drugim tłokiem o ruchu przesuniętym w fazie o 180

°, pracującym z wydajnością ½

(50%) wydajności tłoczenia tłoka czynnego – jako antypulsator. Wydajność naj-
częściej regulowana automatycznie w zakresie 0,1 – 10 ml/min., ciśnienie do
43Mpa. Bywają też stosowane pompy z dwiema lub trzema głowicami z zaworami
ssąco-tłoczącymi i tak napędzame są tłoki, aby wyeliminiwać pulsacje ciśnienia
(wydajności) cieczy.

Schemat ideowy pompy dwugłowicowej z jednym tłokiem czynnym i jednym tło-
kiem biernym

Schemat ideowy pompy dwugłowicowej z dwoma czynnymi tłokami

Inne urządzenia pompujące: pompy strzykawkowe, urządzenia bezpompowe zasi-
lane spręż. Ar lub N

2

(historyczne)

2. Zawór dozujący lub autosampler

_____ - połączenie przewodów w czasie napełniania pętli („ładowanie”)
- - - - - - połączenie przewodów w czasie wprowadzania próby do kolumny

Często zawór Rheodyne Rh 7125.
Pojemności pętli:

"

"

5

20

klasyczne

l

l −

⎭

⎬

⎫

μ

μ

kolumny

l

μ

μ

−

1

⎭

⎬

⎫

l

l

μ

μ

1000

100

semipreparatywna chromatografia lub oznaczanie śladów substancji

3. Kolumny HPLC
mikro

-

kolumny

klasyczne kolumny
analityczne

semi-
preparatywne

średnice d

c

[mm]

0,5

4

8

długość L

c

[mm]

50

250

1000

najczęściej
250 mm

wielkość ziaren
sorbenta [um]

3; 5; 10

15; 25

40

liczba półek teore-
tycznych na 1 m
wypełnienia ko-
lumny

aaaaa

~1

tyś

4. Komora termostatyczna

Zakres temperatur

: pokojowa do 80

°C

lepiej

:

+4

°C do 80°C (biochromatografia)

Korzystne jest, aby termostatowany był również zawór dozujący. Trzeba też ter-
mostatować ciecz doprowadzaną do zaworu dozującego.

Uwagi użytkowe:
- warto co jakiś czas przepłukać przestrzeń za uszczelką w przypadku użycia bufora

jako eluenta.

- Pulsacyjna praca pompy może być spowodowana przylepianiem się zaworu ssące-

go do gniazda – oczyścić w acetonie, izopropanolu, wodzie, w detergencie w łaźni
ultradźwiękowej.

- Ważne, aby wszystkie filtry były drożne - przepłukiwać w przepływie w przeciw-

nym kierunku niż praca filtra, stosując wibracje ultradźwiękowe.

- Filtry mogą być zapychane przez bakterie – stosować NaN

3

lub inne substancje

bakteriobójcze jako dodatki do eluenta nietrującego dla bakterii.

Elucja gradientowa – praktyczne problemy stosowania

1. Problem „odpowietrzenia cieczy” – zapobieganie złej pracy pompy, wysokim szu-

mom detektora, utlenianiu katalitycznemu na sorbencie

Metody: He, ultradźwięki, próżnia, wrzenie, permeacja gazu przez membranę

2. Problem interakcji objętości podczas mieszania (urządzenia wysokociśnieniowe)

3. Zniekształcenia przebiegu programu w wyniku mieszania cieczy w elementach apa-

ratury (urządzenie z zaworami proporcjonującymi) i możliwość przeciwdziałania
skutkom; konieczne określenie zastępczej objętości mieszania i opóźnienia trans-
portowego aparatu

4. Kwestia optymalne objętości miksera

5. Problem interferencji pompa – zawory proporcjonujące

6. Zalecenia praktyczne

- Odłączyć kolumnę.
- określić eksperymentalnie

υ

o

,

υ

a

(test aparatury)

- sprawdzić realizację w praktyce linii prostej, gradientu skokowego oraz powta-

rzalność realizacji – w warunkach liniowej odpowiedzi detektora.

- zminimalizować zbędne objętości mieszania.
- możliwość stosowania „desynchronizacji pracy tłoków pompy i zaworów pro-

porcjonujących

-
7. Wpływ zanieczyszczeń eluenta na przebieg linii bazowej podczas „ślepej próby” i

możliwość odejmowania tego przebiegu (po przyłączeniu kolumny)

8. Metody oczyszczania rozpuszczalników: H

2

O, CH

3

OH, THF, Hexan – patrz Vogel

„Preparatyka organiczna”

Detekcja w LC
1. Zasady ogólne

- poziom szumów i pojęcie czułości detektora, np. 10

-3

AU/FS, tzn. poziom szumów

<10

-5

Jedn. Absorbancji: Cz=Syg./szum

- dryf detektora < 20% skali 100%, np.: 10

-4

AU/h

- zakres liniowości detektora, np. S

i

= k C

i

x

, x

∈ (0,98; 1,02)

- selektywność detektora s=(C

2

/C

1

) > 10

n

; im bardziej n>1 tym bardziej selektywny

detektor

- stała czasowa detektora (T)

(

)

T

t

e

S

S

/

0

1

−

−

=

- detektor stężeniowy: S

s

= C

s

⋅C

i

⎥

⎦

⎤

⎢

⎣

⎡

ml

mg

mV

/

; ( S

s

= f(C

i

) );

- detektor masowy: S

m

= C

m

⋅W⋅C

i

⎥

⎦

⎤

⎢

⎣

⎡

S

mg

mV

/

; (

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

=

dt

dm

f

S

m

);

2. Zestawienie najważniejszych metod detekcji – cechy charakterystyczne

Typ Zakres

przydatności granica

ozna-

czalności

zakres li-
niowości

uwagi

UV-VIS
„klasyczny”

selektywny, substan-
cje aktywne w UV-
VIS (200-800nm)
lub odwrócona de-
tekcja UV, stęże-
niowy [jedn.absorb]

~0,2 ng/ml
~2*10

-5

Jedn.

Absorb.

10

3

- 10

4

Bardzo szeroki zakres
wykorzystania, najważ-
niejszy w HPLC

UV-VIS
„DAD”

190-800 nm
90-1024 fotoelemen-
tów
b.przydatny

~0,5 ng/ml
~5*10

-5

Jedn.Absor.

10

3

- 10

4

Szczególnie potrzebny
podczas doboru warun-
ków rozdzielania, infor-
macje jakościowe

Refraktometr
(„RI”)

„uniwersalny”
(GPC)
elucja gradientowa
wykluczona

~0,7

μg/ml

~2

⋅10

7

Jedn.

Refr.

3

⋅10

3

Typ
- refleksyjny,
- odchyleniowy,
- interferencyjny

Fluorescencyjny
(„FL”)

selektywny
dla substancjji flu-
oryzujących natural-
nie lub odpowied-
nich pochodnych

~0,8 pg/ml

10

3

- 10

4

PAH, katecholaminy,
leki, płyny fizjol., b.
czuły i łatwy w stoso-
waniu

Elektroche-
miczny
(„EC”)

- kulometryczny

(rzadko)

- amperometrycz-

ny (3 elektrody)

Selektywny tylko dla
łatwo redukowal-
nych lub utlen. sub.

~1 pg/ml

-

b. trudny w stosowaniu,
możliwość „zatrucia”
elektrod; b.czuły,

±1,2 V

Konduktome-
tryczny

jonoselektywny

do 0,2% róż-
nicy przewod-
nictwa sub-
stancji

10

5

detekcja jonów w chro-
matografie jonowym

Reakcyjna de-
tekcja

selektywny jak

fluore-

scencyjny lub
UV-VIS

bardzo szerokie zasto-
sowanie. Problem reak-
tora i rozmycia dodat-
kowego.

Radioaktywność selektywność -

do ok. 2000

konieczny scyntylator

ogromna rozkł/min.

Spektrom. ma-
sowy

uniwersalny i
b.czuły, jakościowy i
ilościowy

do 0,1 pg/ml

10

7

b. przydatny, kosztowny

Dyspersja masy i ocena kolumny

1. Dyspersja masy jako efekt niekorzystny lecz nieunikniony

2

'

2

'

2

1

2

1

1

4

1

N

k

k

Rs

⋅

⎟⎟

⎠

⎞

⎜⎜

⎝

⎛

+

⋅

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛ −

=

α

α

2

H

2

L

N

c

=

2. Zjawiska powodujące dyspersję (najważniejsze)

a) wewnątrz kolumny ( w warstwie wypełnienia)

Profil tłokowy jako warunek podstawowy.

u

C

C

A

u

B

L

H

s

m

c

⋅

+

+

+

≅

≡

)

(

2

σ

równanie Van De-
emtera

↑

↑

↑

Dyfuzja

molekul.

Dyfuzja
wirowa
(mieszanie
strumieni)

Opory przenoszenia
masy w fazie ru-
chomej (m) i stacjo-
narnej (s)

b) „ poza kolumną” (poza warstwą wypełnienia)

- dozowanie:

τ

σ

+

=

12

2

2

i

v

V

;

2

2

2

v

L

S

σ

σ

=

c

;

- kapilary łączące

m

D

124

k

k

v

w

d

L

1

1

4

2

⋅

⋅

⋅

=

σ

- kuweta detektora i inne przestrzenie mieszające:

2

2

M

v

V

≅

σ

- „kieszenie” i inne „martwe” przestrzenie

m

v

D

w

x

2

2

2

⋅

≅

σ

-

c) niedostateczna dynamika układu detektor – rejestrator jako przyczyna „pozornej

dyspersji”

2

2

2

w

v

⋅

=

τ

σ

0

2

⇓

+

+

⇓

=

poz

ext

p

c

H

H

d

H

H

3. Oczekiwana sprawności kolumny (j. d

c

=4mm, w=1-1,5ml/min)

d

p

[

μm]

N

o

[1/m]

10

μm

15 – 20 tyś.

7

μm

30 – 35 tyś.

5

μm

50 – 60 tyś.

3

μm

100 – 120 tyś.

4. Warunki podczas testu kolumny

- odtwarzanie warunków testu kolumny
- test indywidualny

• proste substancje łatwo rozdzielające się

• liniowy zakres izotermy sorbcji
• mała objętość dozowania (V

i

< 20

μl ), d

c

=4 mm, L

c

> 100 mm

• dobra dynamika układu detektor - rejestratorr

5. Test pełny kolumny winien opisywać:

a) sprawność kolumny (N),
b) przepuszczalność kolumny (

Φ),

c) selektywność kolumny (k

’

,

α),

d) efekty pozakolumnowe (

)

2

ext

v

σ

e) asymetria pików (As

0,1

)

1. Sprawność kolumny – obliczanie na podstawie chromatogramu

2

2

/

1

54

,

5

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

=

l

S

L

H

c

lub

2

16

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

=

l

S

L

H

c

lub

2

1

2

)

(M

L

H

c

μ

=

2

2

/

1

54

,

5

⎟⎟

⎠

⎞

⎜⎜

⎝

⎛

⋅

=

=

S

l

H

L

N

c

a

b

As

=

1

,

0

T

c

c

d

w

t

L

u

ε

⋅

⋅

Π

=

=

2

0

4

75

,

0

≅

T

ε

2. Sprawność teoretyczna

ν

ν

ν

⋅

+

⋅

+

=

C

A

B

h

teor

33

,

0

B=2, A=1, C=0,1

p

d

H

h

=

;

M

p

D

d

u

⋅

=

ν

3. Przepuszczalność

K

d

p

2

=

Φ

gdzie:

P

L

u

K

c

Δ

⋅

⋅

=

η

500 <

Φ < 2000 najczęściej 1000

4. Test dla efektów pozakolumnowych

∑

≅

2

ext

v

ext

V

cak

σ

σ

t

ext

ext

V

w

S

cak

ν

σ

⋅

⋅

≅

∑

53

,

2

1

2

2

/

1

HPLC – Inne mechanizmy selektywności

SEC/GPC – wykluczanie molekularne – sito molekularne – chromatografia

żelowa

V

e

= V

m/z

+ K

d

(V

0

– V

m/z

)

w

e

M

d

dV

S

ln

=

- „pojemność” rozdzielcza kolumny GPC

np.:

3

2

/

1

1

1

⎥

⎥

⎦

⎤

⎢

⎢

⎣

⎡

⋅

−

≅

p

w

d

r

M

k

k

K

t

z

m

z

m

V

V

/

/

=

ε

t

V

V

0

0

=

ε

4

/

2

c

c

t

L

d

V

⋅

⋅

Π

=

i

z

m

t

z

m

V

V

V

V

ε

⋅

−

+

=

)

(

/

/

0

t

z

w

i

V

V

/

=

ε

Rodzaje faz stacjonarnych (ogólnie):
- pęczniejące (wymagające przygotowania) – uwaga na

ΔP

- twarde
• liofilowe

• hydrofilowe – dezaktywacja np. glikol polietylenowy

Specyfika wykorzystania GPC – dla biopolimerów – białka, cukry, wirusy

Możliwość łączenia kolumn

Stosowane eluenty
Eluent toluen

THF

aceton

dwuchlo-
robenzen

DMFA

„Siła elucyjna” w/g Bartona

8,9

9,1

9,9

10,1

12,1

Problemy i zakłócenia, które trzeba brać pod uwagę:
- możliwość oddziaływań sorbcyjnych,
- pęcznienie i kurczenie się żelu pod wpływem różnych substancji
- ściśliwość żelu,
- b. wolna dyfuzja makromolekuł,
- wzajemne przeszkadzanie molekuł i zatykanie niektórych porów,
- polikondensacja makromolekół
- i inne

Ilościowe oznaczanie rozkładu mas cząsteczkowych – metodyka:
- kalibracja bezpośrednia – problem posiadania wzorców,

- kalibracja z wykorzystaniem polimerów polidyspersyjnych,

- kalibracja uniwersalna log( [

η]⋅M

w

) = f( V

e

)

Problem eliminacji wpływu dyspersji hydrodynamicznej podczas określania f(M

w

)

- dostępność specjalistycznego oprogramowania,
- wyspecjalizowane integratory

LLSD

Detekcja -: RI, UV, Lepkość,

Typy żeli handlowych:
Organiczne Nieorganiczne

(często modyfikowane)

• dekstranowe (Sephadex G10-G200, LM-20,

LH60, Sephacryl)

• agarozowe (Sepharosc, Biogel A, Ultragel A, …)

• akrylowe, metakrylowe (Biogel P, Ultragel ACA,

…)

• polistyrenowe (PS-DVB, TSK G1000-G7000,

PORAGEL 60-500, Lichrogel PS 1-4000)

• silikażele (Lichrospher SI 100 –4000,

TSK-GEL SW 2000-4000)

• szkła porowate – CPG 40-3000

Å

• alumina

Literatura
M.Berek, M.Dressler, M.Kubin, K.Marcinka „Chromatografia żelowa”, PWN, War-
szawa, 1989

Chromatografia jonowymienna IC

1. Typy wymieniaczy jonowych:

a) Kationit (kwas)

- mocny, np.:
- słaby, np.:

b) Anionit (zasada)

- mocny, np.:
- słaby, np.:

c) wymieniacze z dodatkowymi oddziaływaniami sorbcyjnymi

Szeregi w kierunku malejącej siły elucyjnej przeciwjonu:

• wymiana kationów: Ba

2+

, Pb

2+

, Sr

2+

, Ca

2+

, Ni

2+

, Cd

2+

, Cu

2+

, Co

2+

, Zn

2+

, Mg

2+

,

Mn

2+

, UO

2

2+

, Te

+

, Ag

+

, Cs

+

, Rb

+

, K

+

, NH

4

+

, H

+

, Li

+

• wymiana anionów: cytrynian, siarczan, szczawian, BO

3

-3

, NO

3

-

, PO

4

-3

, Br

-

,

SCN

-

, CN

-

, NO

2

-

, Cl

-

, HCOO

-

, CH

3

COO

-

, F

-

, OH

-

, ClO

-

.

2. Wpływa na retencję:

- typ wymieniacza jonowego,
- pH fazy ruchomej,
- siła jonowa fazy ruchomej,

- rodzaj przeciwjonu

3. Reguły ogólne

- wzrost siły jonowej przeciwjonu obniża V

R

,

- w przypadku wymiany kationu:

• wzrost pH obniża retencję; wyjątek: słabe wymieniacze kationów lepiej dyso-

cjujące przy wzroście pH

- w przypadku wymiany anionu

• spadek pH obniża retencję; wyjątek: słabe wymieniacze anionów lepiej dysocju-

jące przy niższym pH

- rodzaj przeciwjonu w/g następujących reguł podwyższa retencję próby:

• im wyższy ładunek przeciwjonu,

• im mniejsza średnica przeciwjonu,

• im łatwiej polaryzowalny przeciwjon

Zalecenia praktyczne
- wykorzystanie dla separacji najwyżej 5% pojemności,
- pH

≥ pK

s

+ 1,5 (zasady) lub pH

≤ pK

s

–1,5

- substancje

przeciwgrzybowe, przeciwgrzybiczne

: NaN

3

, kwas kapronowy, CCl

4

,

fenol,

- płukanie tłoka pompy !

Detekcja:
- przewodnictwo elektr. – konieczność stosowania supresji jonów !
- odwrotna detekcja UV

Alternatywy dla chromatografii jonowymiennej:
- chromatografia par jonowych C18, C8, C2

??

- cofanie dysocjacji słabych kwasów lub zasad

??

Przykłądy przeciwjonów

??

- kwas p-amini benzoesowy

Chromatografia powinowadztwa (affinity chromatography)

Etapy:
1) związanie liganda z nośnikiem,
2) sorbcja specyficzna cząsteczek P (powinowadztwo)
3) odszczepienie P

• czynnikiem o silniejszym powinowadztwie,

• zmiana pH,

• nadmiarowe stężenie jonów

4) reaktywacja sorbenta

Przykłady
♦ oznaczanie glukohemoglobiny HbGl – metoda kliniczna,

♦ przeciwciała z zastosowaniem Anty IgG – ligandów

♦ proteiny roślinne z zastosowaniem Concanavaliny A i inne.

Rozdzielanie enancjomerów

Mechanizmy
- prekolumnowe lub wewnątrzkolumnowe tworzenie i separacja diastereoizomerów –

optycznie czynne dodatki do eluenta

- wykorzystanie oddziaływań

Π - Π, dipol – dipol, -OH

-…

H

+

, (optycznie czynne fazy

stacjonarne)

Typy faz stacjonarnych:
- kompleksy Cu

+2

– aminokwas; rozdzielanie: aminokwasy, dwupeptydy, 2 OH kwa-

sy karboksylowe

- polimery helicalne – trójacetyloceluloza, poli-triphenyl metyl metakrylan,
-

β-cyklodextryna związana na SiO

2

,

- fazy chiralne typu szczotkowego – tzw. fazy Pirkla, np. dinitrobenzoilofenyloglicy-

na, dinitrobenzoiloleucyna

związane jonowo

??

związane kowalencyjnie

??

-

Analiza ilościowa w chromatografii

???????

1. Metoda krzywej kalibracyjnej lub „standardu zewnętrznego”

2. Metoda wzorca wewnętrznego

Substancja (wzorzec) dodawana do próbki
– nie może występować w próbce,
– musi mieć podobne właściwości jak substancja analizowana
Zalety metody

• nie jest konieczne precyzyjne dozowanie,

• możliwa złożona obróbka próby
Wady
• niekiedy trudno dobrać wzorzec,

• stężenie wzorca w próbce musi być dokładnie znane

3. Metoda dodatku wzorca („fortyfikacji”)
- jednokrotny dodatek – wymuszenie „zer – zero”
- dwukrotny dodatek – zróżnicowany - pewniejszy

Znaczenie symboli nie wyjaśnionych w tekście

Aparatura HPLC

d

c

-

średnica wewnętrzna kolumny;

L

c

-

długość wypełnienia w kolumnie;

w -

natężenie przepływu eluenta – objętościowo [ml/min];

d

p

-

wielkość ziaren wypełnienia;

X -

ułamek objętościowy składnika B w eluencie;

t -

czas;

υ -

objętość eluenta,

V

mix

-

objętość mieszania;

υ

0

-

opóźnienie transportowe [ml],

υ

a

-

zastępcza objętość mieszania w elementach chromatografu cieczowego,

Δ -

amplituda

wahań stężenia składnika B w eluencie,

C

z

-

czułość detektora;

S

i

, S

s

, S

m

, S

0

– sygnał detektora, odpowiednio: S

i

– w odpowiedzi na stężenie c

i

, S

s

–

detektora stężeniowego, S

m

– detektora masowego, S

0

– pełny sygnał odpowe-

idzi;

C

s

-

czułość detektora stężeniowego;

C

m

-

czułość detektora masowego;

m

- masa substancji wpływającej do detektora;

dm/dt - szybkość doprowadzania masy do detektora;
UV-VIS - detektor foroabsorbcjometryczny;
s -

selektywność detektora;

R

s ½

-

stopień rozdzielenia substancji 2/1 (pików 2/1);

α

- retencja względna,

k’

2

-

współczynnik retencji substancji II;

N

2

- liczba półek teoretycznych kolumny dla substancji 2;

d

p

-

średnica ziaren wypełnienia kolumny;

H -

wysokość wypełnienia równoważna półce teoretycznej (HETP);

H

c

- j.w., ale tylko dla samego wypełnienia (po odjęciu tzw. efektów pozakolum-

nowych);

u

- liniowa prędkość przepływu eluenta w kolumnie;

2

2

,

L

v

σ

σ

- liczone objętościowo (v) i liniowo (L) wariancje składowe rozkładu stężenia

wzdłuż kolumny,

L

- droga elucji;

C, B, A, C

m

, C

s

, - stałe dla konkretnej kolumny i równania;

Vi -

objętość dozowania;

S

c

- powierzchnia przekroju poprzecznego wypełnienia kolumny;

L

k

-

długość kapilary;

d

k

-

średnica kapilary;

w -

natężenie przepływu eluenta;

D

m

-

współczynnik dyfuzji molekularnej w eluencie

V

m

-

objętość mieszania;

X

- wymiar „znamienny” kolory;

τ -

stała czasowa detektora (0,632 amplitudy So osiągane jest po czasie

τ)

H

ext

-

wysokość równoważna półce teoretycznej od efektów pozakolumnowego
rozmycia;

H

prz

-

wysokość równoważna półce teoretycznej od złej dynamiki detektora;

N

0

- liczba półek teoretycznych kolumny w przeliczeniu na 1 m długości wypełnie-

nia;

d

c

-

średnica wypełnienia kolumny;

Φ -

przepuszczalność właściwa kolumny,

A

s0,1

-

współczynnik asymetrii piku w 0,1 wysokości;

S

1/2

-

szerokość piku w ½ wysokości;

S -

szerokość piku przy podstawie;

l -

odległość mierzona na chromatogramie (w warunkach elucji izokratycznej i
stałego natężenie przepływu eluenta);

μ

2

- drugi moment centralny piku jako krzywej rozkładu;

M

1

- pierwszy moment zwykły piku jako krzywej rozkładu (położenie środka cięż-

kości);

to

- czas retencji substancji niesorbowanej;

h

- tzw. zredukowana wysokość półki teoretycznej;

h

teor

-

wartość h otrzymana z równania Knoxa;

ν

- zredukowana prędkość przepływu eluenta;

η -

lepkość dynamiczna eluenta;

K -

przepuszczalność kolumny;

H

ext

-

udział efektów pozakolumnowych w H;

∑

2

ext

v

σ

- objętościowo liczona wariancja rozmycia pozakolumnowego stref substancji;

∑

2

2

/

1

ext

S

- udział rozmycia pozakolumnowgo w wartości kwadratu szerokości piku w

połowie wysokości;

F

c

- pole przekroju poprzecznego wypełnienia kolumny;

υ

t

-

szybkość przesuwu papieru rejestratora;

L

c

-

długość wypełnienia w kolumnie;

a, b

- część szerokości piku w 0,1 wysokości (patrz szkic);

V

R

-

objętośći retencji

HPLC Inne mechanizmy selektywności

Chromatografia żelowa (GPC/SEC)

V

e

-

objętość elucji (do maksimum albo do środka ciężkości piku

V

m/2

-

objętość międzyziarnowa wypełnienia;

V

0

-

objętość ”martwa” kolumny (objętość przebicia przez substancję o niskiej ma-
sie cząsteczkowej – wnikającej we wszystkie pory ziaren wypełnienia);

M

w

-

średnia masa cząsteczkowa polimeru (wagowo);

k, k

1

, A, B – stałe;

r

p

-

średni promień porów wypełnienia w ziarnach;

ε

0

-

porowatość całkowita kolumny;

ε

m/z

-

porowatość międzyziarnowa wypełnienia;

ε

i

-

porowatość wewnętrzna ziaren sorbenta;

V

w/z

-

objętość porów wewnątrz ziaren sorbenta;

V

t

-

objętość „pustej” (niewypełnionej) kolumny;

L

c

-

długość wypełnienia kolumny;

d

c

-

średnica wypełnienia w kolumnie – średnica kolumny;

M

min

, M

max

– odpowiednio: minimalna i maksymalna masa cząsteczkowa substancji

podlegających efektowi sita molekularnego w danej kolumnie;

M

śr

-

średnia masa cząsteczkowa polimeru;

η -

lepkość;

[

η] -

lepkość graniczna (roztworu nieskończenie rozcieńczonego polimeru);

P

- pole pod częścią krzywej rozkładu stężenia (piku);

LLSD - detektor laserowy światła rozproszonego;
THF -

tetrahudrofuran;

DMFA - di-metyloformamid;

Chromatografia jonowymienna
P

r

-

cząsteczki substancji rozdzielanych albo ich stężenie;

B -

przeciwjon;

pKs - pK kwasu lub zasady

Analiza ilościowa w chromatografii
A

i

- powierzchnia piku „i”;

h

i

-

wysokość piku „i”;

C

i

-

stężenie substancji „i”;

m

i

- masa substancji „i”;

A

wz

- powierzchnia piku wzorca wewnętrznego;

m

wz

- masa wzorca;

Δm

1/2

- masa dodatku wzorca;

m

x

- masa substancji oznaczanej;

C

x

-

stężenie substancji oznaczanej;

a

3

, a

2

, a

1

, a

0

– współczynniki wielomianu;