Instrukcja do ćwiczenia:

Chromatografia Cienkowarstwowa

Kierunek: Biotechnologia
Rok II
Przedmiot: Procesy rozdzielania i oczyszczania produktów biotechnologicznych – laboratorium
Opracował dr Tomasz Girek

Częstochowa 2008

INSTYTUT CHEMII I OCHRONY ŚRODOWISKA

WYDZIAŁ MATEMATYCZNO – PRZYRODNICZY

AKADEMIA im. JANA DŁUGOSZA

CZĘSTOCHOWA

1. Wprowadzenie

Chromatografia adsorpcyjna jest najstarszą metodą chromatograficzną. Wykorzystuje różnice w

adsorpcji związków chemicznie podobnych na powierzchni sproszkowanego i nasyconego
rozpuszczalnikiem adsorbentu.

Adsorbent nie może reagować z substancjami rozdzielanymi ani z rozpuszczalnikiem, musi być

nierozpuszczalny w danym rozpuszczalniku i wykazywać odpowiednią aktywność w wiązaniu
rozdzielanych substancji. Rozdział zależy od natury adsorbentu i rozpuszczalnika. Poniżej podano
najczęściej używane adsorbenty i rozpuszczalniki uporządkowane według wzrastającej aktywności:

Adsorbenty: sacharoza < skrobia < talk < węglan sodowy < węglan potasowy < węglan wapniowy <

fosforan wapniowy < węglan magnezowy < tlenek magnezowy < tlenek wapniowy < żel
krzemionkowy < krzemian magnezowy < tlenek glinowy < węgiel aktywny < ziemia Fullera.

Rozpuszczalniki: eter naftowy (benzyna lekka) < czterochlorek węgla < cykloheksan < dwusiarczek

węgla < eter etylowy < aceton < benzen < estry kwasów organicznych < chloroform < etanol < woda
(zależnie od pH i rozpuszczonych soli) < pirydyna < kwasy organiczne.

Najsilniej adsorbuje węgiel aktywny i ziemia Fullera, najsłabiej sacharoza i skrobia. Najlepiej

adsorbują się związki rozpuszczone w eterze naftowym, a najsłabiej w pirydynie, wodzie i
kwasach organicznych. Do elucji lepiej nadają się rozpuszczalniki polarne (etanol, woda, pirydyna)
niż niepolarne, takie jak eter naftowy czy chloroform.

W chromatografii adsorpcyjnej rozdział zależy od siły, z jaką dana substancja jest adsorbowana z

rozpuszczalnika otaczającego fazę stałą. Warunkiem uzyskania dobrego rozdziału jest równomierne
wypełnienie kolumny suchym i odpowiednio oczyszczonym adsorbentem oraz właściwe wymiary
kolumny. Najczęściej stosunek średnicy rurki szklanej do jej długości wynosi 1:20.

W trakcie sączenia badanego roztworu przez kolumnę substancje silniej adsorbowane przesuwają się
wolniej, a słabo adsorbowane — szybciej. W przypadku barwników roślinnych, na różnej
wysokości kolumny powstają barwne pasma odpowiadające poszczególnym barwnikom. W celu
lepszego rozdzielenia pasm kolumnę przemywa się tym samym rozpuszczalnikiem, albo innym o większej
sile wymywania, wskutek czego warstwy szybciej przesuwają się ku dołowi i lepiej się rozdzielają.

II. Cel i wykonanie ćwiczenia

Celem

ć

wiczenia

jest

chromatograficzne

rozdzielenie

barwników

organicznych

i

nieorganicznych, oraz poszukiwanie najlepszego eluentu w chromatografii TLC.

Ć

wiczenie 1. Wykrywanie kwasu askorbinowego (witaminy C) w soku z pomarańczy lub cytryny

Sprzęt:

probówki, zlewki 100ml, szkiełka zegarkowe, kapilary, bagietki, cylinder miarowy 10ml

Odczynniki:

substancja wzorcowa (tabletka witaminy C rozpuszczona w wodzie), sok z cytryny lub

pomarańczy, eluent: etanol i benzen w stosunku 3:1, wywoływacz chromatogramu - jod.

Wykonanie:

Niewielką ilość badanego soku wlać do probówki i dodać wody do połowy jej objętości. Po

wymieszaniu bagietką, roztwór nanieść przy pomocy kapilarki na linię startową płytki
chromatograficznej. W pewnej odległości od powstałej plamy nanieść krople substancji wzorcowej. Po
wysuszeniu plam, płytkę umieścić w komorze chromatograficznej zawierającej etanol i benzen. Gdy
mieszanina rozpuszczalników znajdzie sie w odległości ok. 2 cm od górnej krawędzi płytki, należy ją
wyjąć z komory chromatograficznej i przenieść do drugiej komory, na dnie której umieszczono
niewielką ilość jodu. Chromatogram nasycony parami jodu identyfikuje witaminę C zawartą w soku.

Na podstawie otrzymanego chromatogramu, wyznaczyć współczynnik R

f

(współczynnik przesunięcia)

dla poszczególnych składników mieszaniny i substancji wzorcowych, korzystając z zależności:

B

A

R

f

=

gdzie: A - odległość plamy substancji rozdzielonej od miejsca (środka) nałożenia na płytce.

B - odległość frontu rozpuszczalnika od miejsca nałożenia próbki.

Ć

wiczenie 2. Poszukiwanie najlepszego eluentu dla mieszaniny amin aromatycznych

Sprzęt:

płytki chromatograficzne, probówki, zlewki 100ml, szkiełka zegarkowe, kapilary, bagietki,

cylinder miarowy 10ml, lampa UV

Odczynniki:

o-nitroanilina, p-nitroanilina, heptan, heksan, izopropanol

Wykonanie:

Na płytki z żelem krzemionkowym nanieść „plamki startowe” orto-nitroaniliny i para-

nitroaniliny w heptanie. Plamki nanosimy na żel za pomocą kapilary. Płytki należy wstawić do komory
chromatograficznej i rozwijać w kilku alternatywnych układach rozpuszczalników (heksan z 5%, 10%, 15%,
20%, 25% zawartością izopropanolu v/v). Płytki rozwijać do linii mety. Po rozwinięciu płytki TLC oglądać
w świetle lampy UV, przy długości światła 254nm i 360 nm.

• Na podstawie uzyskanych chromatogramów wyznaczyć wartości R

f

analizowanych substancji,

oddzielnie dla poszczególnych warunków rozdzielania.

•

Na podstawie wartości R

f

uzyskanych z zastosowaniem różnych eluentów zaproponować optymalny

skład fazy ruchomej do rozdzielania mieszaniny amin aromatycznych

Ć

wiczenie 3. Chromatografia cienkowarstwowa tuszów flamastrów na żelu krzemionkowym

Sprzęt:

płytki chromatograficzne, probówki, zlewki 100ml, szkiełka zegarkowe, płytka porcelanowa z

wgłębieniami, kapilary, bagietki, cylinder miarowy 10ml,

Odczynniki:

octan etylu, etanol, woda, różne mazaki

Wykonanie:

Na płytki z żelem krzemionkowym nanieść „plamki startowe” mazaków o różnych kolorach, w

razie problemów z naniesieniem plamek zanurzamy na moment końcówkę mazaka w niewielkiej ilości
etanolu lub acetonu w zagłębieniu płytki porcelanowej. Plamki nanosimy na żel za pomocą kapilary. Płytki
należy wstawić do komory chromatograficznej i rozwijać w eluencie o składzie: octan etylu, etanol, woda
5:3:2. Płytki rozwijać do linii mety. Po rozwinięciu płytki TLC oglądać w świetle dziennym oraz pod lampą
UV, przy długości światła 254nm i 360 nm.