Budowa

Budowa

cytometru

cytometru

przepływowego

przepływowego

Układ ciśnieniowo-cieczowy

Inaczej nazywany układ hydraulicznym, który

dostarcza zawiesiny badanych komórek do

komory pomiarowej. W czasie przechodzenia

przez komorę zawiesina komórek otoczona jest

izotonicznym płynem osłonowym i przepływa

równomiernie, co zapobiega zlepianiu się

komórek. Konstrukcja cytomeru zapewnia

laminarny przepływ komórek i ich dostatecznie

niskie stężenie tak, aby przepływały pojedynczo

dokładnie w środku kanału.

Najważniejszym elementem układu ciśnieniowo-

cieczowego jest pompa powietrzna. Wytwarza

ona i podtrzymuje podciśnienie stanowiące siłę

napędową buforu roboczego i zawiesiny komórek

Inne części to:
• Regulatory ciśnienia powietrza
• Regulator ciśnienia cieczy
• Filtr buforów
• Filtr powietrza
• Zbiorniki na bufor roboczy
• Zbiorniki na odpadki
• Komora przepływowa

Istotnym elementem układu jest
system transportu cieczy ze
specjalnym buforem. Posiada on
właściwości fizyczne pozwalające na
uformowanie cienkiego strumienia
zawiesiny komórek o średnicy 10-
100μm na zasadzie ogniskowania
hydrodynamicznego.

zawiesina
komórek

fluorescencja

fluorescencja

promień lasera

promień lasera

ciecz osłaniająca

PRZEPŁYW KOMÓREK

Źródło światła

Źródłem światła są lasery emitujące

światło spójne, monochromatyczne o
dużym natężeniu i małej średnicy
promienia, przeważnie spolaryzowane
pionowo, o różnych długościach fal- od
UV poprzez światło niebieskie, zielono-
żółte do czerwonego.

Najpowszechniej stosowane są lasery

gazowe:

• argonowy (najpowszechniejszy, emitujący

światło o długości fali 488 nm)

• kryptonowy
• kryptonowo-argonowy
• helowo-neonowy
• helowo-kadmowy

Coraz częściej jednak firmy produkują lasery

zbudowane na bazie kryształów ciał stałych.

Układ kształtujący i

ogniskujący wiązkę laserową

na komórce

Każdy laser emituje światło o

charakterystycznej długości fali, a
specjalne filtry przepuszczają tylko
określone pożądane długości fali, co
jest konieczne ze względu na
szerokie widmo emisyjne
fluorochromów.

Stosuje się filtry:
• absorpcyjne (odcinające), które

przepuszczają światło o właściwej długości
fali

• interferencyjne, które wzmacniają lub

osłabiają daną długość fali

Szerokie widmo światła spowodowałoby, że

w cytometrach wielokolorowych
nieoddzielone sygnały poszczególnych
barwników fluorescencyjnych nachodziłyby
na siebie.

Optyka zbierająca sygnały

Optyka zbierająca sygnały rejestruje

światło załamane na komórce oraz
wyemitowane przez fluorochrom
promieniowanie fluorescencyjne. Do
tego celu stosowane są układy
luster, pryzmaty, soczewki
zbierające światło ugięte,
rozproszone i fluorescencję,
detektory.

•

SYSTEM OPTYCZNY

SYSTEM OPTYCZNY

SYSTEM OPTYCZNY

SYSTEM OPTYCZNY

lustro
dichroiczne

filtr zaporowy

laser

przepływ
komórek

PMT 5

PMT 1

PMT 2

PMT 4

PMT 3

detektor światła
rozproszonego

próbka

Cytometr wyposażony
jest przeważnie w kilka
niezależnie
pracujących
detektorów
odczytujących
intensywność światła
rozproszonego i
fluorescencji o różnych
długościach fal. Czas
odczytu jest bardzo
krótki (ułamki
milisekundy), jego
efektem jest wysłanie
przez detektor impulsu
elektrycznego o
wielkości
proporcjonalnej do
natężenia odebranego
sygnału świetlnego.

PRZEDNI DETEKTOR ŚWIATŁA
ROZPROSZONEGO (Forward
Scatter)

• Ilość światła rozproszonego wzdłuż

osi przebiegu światła wzbudzającego
jest zbierana przez przedni detektor
światła rozproszonego (forward
scatter channel). Intensywność
tego światła jest proporcjonalna do:
rozmiaru, kształtu i
granularności cytoplazmy.

detektor
przedni

laser

PRZEDNI DETEKTOR
ŚWIATŁA
ROZPROSZONEGO

BOCZNY DETEKTOR ŚWIATŁA
ROZPROSZONEGO (Side Scatter)

Ilość światła rozproszonego prostopadle

do osi przebiegu światła wzbudzającego
jest zbierana przez boczny detektor
światła rozproszonego ustawiony pod
kątem 90

0

(side scatter channel).

Intensywność tego światła jest
proporcjonalna do: rozmiaru, kształtu
i granularności cytoplazmy.

detektor boczny

laser

BOCZNY DETEKTOR
ŚWIATŁA ROZPROSZONEGO

DETEKTORY FLUORESCENCJI

• Fotopowielacze (ilość od 2 do 4)
• można używać kilku barwników

fluorescencyjnych lub
wyznakowanych przeciwciał.

• Selektywność sygnału zapewniają

odpowiednio dobrane filtry
optyczne i lustra.

laser

Fr

e

q

Fluorescence

detektor
przedni

detektory fluorescencji
(PMT3, PMT4 etc.)

DETEKTORY
FLUORESCENCJI

W układzie elektroniki jako detektorów

używa się fotopowielaczy. Wychodzący z
nich impuls dociera do wzmacniacza a
dalej do układu, który odczytuje wartość
szczytową każdego impulsu, porównuje
ją z nastawionym progiem rejestracji i w
przypadku, gdy sygnał przekracza tę
wartość, kieruje go do przetwornika
analogowo-cyfrowego. Po
przekształceniu sygnału na postać
cyfrową jest on wysyłany do komputera
celem dalszej analizy i przechowywania.

System komputerowy

Jest wraz z oprogramowaniem integralną i

niezbędną częścią każdego aparatu. Dzięki

wprowadzeniu standardu zapisu danych

istnieją programy, które można używać do

odczytu zbiorów danych z różnych

aparatów. Najważniejsze z nich to programy

przeznaczone do zbierania danych i

programy służące do analizy zebranego

materiału. Te ostatnie pozwalają na

wszechstronną obróbkę danych z

możliwością ilościowej , jakościowej i

statystycznej oceny wybranych populacji

komórek.

Działanie cytometru

przepływowego

• Działanie cytometru przepływowego

polega na badaniu wąskiego strumienia
komórek, przepuszczanego przez strefę
pomiarów, gdzie pada nań światło lasera.

• Bezpośrednio przed komorą przepływową

zawiesina komórek z próbki jest
wprowadzana w bieg buforu roboczego
przez całą długość komory oraz punkt
detekcji komórki płyną laminarnie z
odpowiednią szybkością, jedna za drugą.

• Ich strumień przecina wiązka światła

laserowego, która jest rozpraszana w
kierunku prostopadłym lub równoległym.
Jednocześnie emitowane jest światło
wzbudzone przez barwniki
fluorescencyjne.

• Detektory o bardzo wysokiej czułości

rejestrują światło załamane na każdej
pojedynczej komórce oraz wysyłane przez
wzbudzony fluorochrom sprzężony z
komórką za pośrednictwem przeciwciała.

• Wyniki pomiarów przesyłane są do

komputera, poddawane analizie i
przedstawiane na ekranie monitora w
formie graficznej.

• Po pomiarach komórki i bufor roboczy

trafiają do zbiornika na odpady.

Sortery, oprócz zbierania danych o

przepływających komórkach, dają
możliwość ich precyzyjnej izolacji,
zgodnie z ustawieniami
wprowadzonymi przez operatora.