Kaseta z negatywami

Głowica

z preparatem

Działo elektronowe

Ekran fluorecencyjny

Kamera

Apertura

Apertura

Transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM)

UTRWALANIE

DEHYDRATACJA

PRZESYCANIE ŻYWICĄ

ZATOPIENIE W ŻYWICY

KROJENIE ULTRACIENKICH SKRAWKÓW

KONTRASTOWANIE

M

M

M

M

szary

srebrny

złoty

purpurowy

niebieski

60

nm

90

150

190

240

nm

nm

nm

nm

skrawki używane do mikroskopu
elektronowego

Rys. Zależność pomiędzy grubością skrawka a jego barwą interferencyjną

SEM of a Flower Spike

Note the great depth of field

Same stereocilia as in previous slide viewed using
Nomarski optics (B) and TEM (C ).

In situ metody pozwalające lokalizować kwasy
nukleinowe.

In situ

i in vivo

detekcja of DNA

i RNA:

Fluorescencyjna

in situ hybrydyzacja

(FISH)

Fluorescencyjne

barwniki takie jak: DAPI,

IP, TOTO

GFP konstrukty białek

związanych z chromatyną

takich jak histony.

In situ i in vivo

eksperymenty z użyciem

BrdU

In situ wykrywanie

transkrypcji z użyciem

BrUTP, Cy3-UTP..

Fluorescencyjna

in vivo hybrydyzacja

(FIVH)

Inne metody in situ

takie jak np.

in situ nick translacja

In situ PCR

i in situ RT PCR

In situ

i in vivo

detekcja of DNA

i RNA:

Fluorescencyjne

barwniki takie jak: DAPI,

IP, TOTO

In situ

i in vivo

detekcja of DNA

i RNA:

Fluorescencyjne

barwniki takie jak: DAPI,

IP, TOTO

Cięcie optyczne

z

x

y

Nucleoli

Mitochondria &
plastids

In situ

i in vivo

detekcja of DNA

i RNA:

In situ i in vivo

eksperymenty z użyciem

BrdU

In situ wykrywanie

transkrypcji z użyciem

BrUTP, Cy3-UTP..

In situ lokalizacja transkrypcji
inkubacja z

Br UTP

- Lupinus luteus

In situ localization of transcription

Br UTP

incubation - Lupinus luteus

In situ localization of transcription

Br UTP

incubation - Lupinus luteus

In situ localization of transcription

Br UTP

incubation - Lupinus luteus

In situ localization of transcription

Br UTP

incubation - Lupinus luteus

Solovei et al.. 2001

In situ

i in vivo

detekcja of DNA

i RNA:

GFP konstrukty białek

związanych z chromatyną

takich jak histony.

In situ

i in vivo

detekcja of DNA

i RNA:

Fluorescencyjna

in situ hybrydyzacja

(FISH)

A whole-mount in situ hybrydyzacja (WISH)

i in situ hybridization w całych komórkach.

In situ hybridization półcienkie skrawki.

Przygotowanie materiału

Półcienkie skrawki

W komórkach roślinnych i zwierzęcych błona komórkowa a w
komórkach roślinnych ściana komórkowa są barierami, które nie
pozwalają na swobodną penetracje przeciwciał do wnętrza
komórki gdzie znajdują się poszukiwane antygeny.

Najczęściej stosowany sposób – uzyskanie półcienkich
skrawków.

Zalety:
*Idealny do badań tkankowych – zachowany układ komórek w
tkance.

Wady:
*Obserwacja tylko fragmentu komórki.
*Pracochłonna technika.
*Możliwość utraty lub zablokowania części antygenów podczas
preparatyki materiału.

Szukana sekwencja
DNA lub RNA

Bufor hybrydyzacyjny

Znakowane sondy

półcienki skrawek
0.1



m – 0.1 mm

Szkiełko podstawowe

Błona komórkowa

Półcienkie skrawki

Półcienkie skrawki

Skrawki paraffinowe

Inne usuwalne

żywice: BMM, PEG,

Technovit.....

Cryo-skrawki

Vibroskrawki

Vibratom:

Skrawki - aż do 100 m (0.1

mm)
Przez kilka minut materiał
„żywy”

a

b

c

wz

ch

n

m

p

m

ł

p

o2

o1

Ovary

Jak dotrzeć do wnętrza komórki: microiniekcja

Kontrast fazowy:
obraz komórki

Podczas iniekcji
przeciwciał.

Permeabilizacja błon komórkowych, izolacja protoplastów:

Permeabelizacja

:

-Detergent (Triton X 100)

-Electroporacja
-Streptolysin O
-Scrape-loading
-Wielokrotne zamrażanie
-Peptidemediated
membrane transfer

Enzymatyczne lub chemiczne trawienie
Ściany komórek roślinnych:
pektynaza, celulaza maceroenzym....

-Żywe komórki pH 5.4-5.8, temp. ~23

O

C

-Komórki utrwalone pH 4.6-4.8, temp. 37

O

C

Hipertonic solution

Plasmolysis of intact plant cells can be
used to facilitate the passage of DNA

Electroporation can then be used to transfer
the macromolecules into plant cells.

Fang-Sheng   et al. 2001