Tempo reinicjacji zależy między innymi od tempa
uwalniania RNA pol III z miejsca terminacyjnego.
Odpowiada i reguluje to czynnik białkowy La

Eukariotyczna polimeraza I

Enzym prowadzący 45S pre-rRNA

Wynikiem jego aktywności jest ok. 60%
całkowitej puli jądrowej syntezy RNA

U człowieka występuje ok. 130 aktywnych genów rRNA

Eukariotyczna polimeraza I

Pre-rRNA

blok transkrypcyjny rDNA

IGS

Promotor

Oddysocjowanie

Pol I i RNA

wolna pula polimerazy I

związana z matrycą

pula polimerazy I

PIK

De novo

przyłączenie Pol I

Terminacja transkrypcji

• PTRF (polymerase and transcript release factor)

– czynnik uwalniający polimerazę i transkrypt

• TTF-I (transcription termination factor) czynnik

kończący transkrypcję

Na jednym genie znajduje się jednocześnie
ok. 100-120 Pol I

Tempo syntezy tego enzymu to ok. 40 nukleotydów/s

Inicjacja następuje więc co ok. 3 s

mRNA:

1. geny aktywowane są z różną

częstotliwością od kilku sekund do
kilkunastu godzin

2. rozmiar pre-mRNA: od kilkuset do kilku

milionów par zasad

Co wpływa na tak różny poziom ekspresji (ponad 1000 x) różnych genów?

1. Różnorodność elementów promotorowych.

2. Obecność wielu czynników aktywujących lub
spowalniających sam proces transkrypcji

3. Zjawiska związane z reinicjacją kolejnej rundy transkrypcyjnej

4. Stabilizacja czynników transkrypcyjnych na promotorze.

5. Tempo elongacji (związane z czterema elementami dojrzewania mRNA)

6. Recykling białkowych„ruchomych” elementów systemu: np. polimerazy

Eukariotyczna polimeraza II

Dla genów polimerazy II dodatkowo na tempo reinicjacji

a zatem na poziom ekspresji wpływają takie procesy jak

czapeczkowanie 5’ konca, splicing, a przede wszystkim

poliadenylacja.

Polimeraza bakteryjna

Holoenzym bakteryjnej pol RNA:



Efekt konkurencji czynnika sigma

Czynniki stałe i fakultatywne

Efekt poziomu cz. Sigma na tempo wzrostu bakterii



Regulatory polimeraz:

1. Polimeraza bakteryjna –białko Rap (regulacja tau70)

2. Polimeraza III - białko La

3. Polimeraza I - białko C

4. Polimeraza II - fosforylacja CTD domeny, ubikwitynizacja

Proporcja gen/polimeraza u prokariota i eukariota jest stała !

E. coli ~2600 operonów i ~ 2000 polimeraz

Człowiek ~ 30-40 tyś genów i 40-60 tyś pol II

Mediator i TFIIH obecne w małej ilości kopii ~6000

Czynników „ruchomych” kilka razy
więcej: TFIIB, TFIIF ~ 20 000 kopii
Są w „nadmiarze” i mogą
oddysocjowywać i reasocjować.

80% genów ulega ekspresji na bardzo niskim poziomie: 0.1-1
cząsteczkina komórkę. Gdy zachodzi potrzeba stabilny PIK
pozwala na wysoką ekspresje.

Dla tych genów PIK jest niestabilny i ulega ciągłej dysocjacji i reasocjacji

Alternatywnie – model fabryk transkrypcyjnych: zgrupowanie po
kilka genów i nagromadzenie czynników transkrypcyjnych w
określonej przestrzeni.

Zgrupowanie w genomie różnych genów (średnio ok. 10) o podobnej ekspresji

Polimeraza

II:

Kompleks

białkowy

utworzony z

2 dużych

podjednoste

k

RPB1 i

RBP2

i 10

mniejszych

Składa się

z domeny

C-

końcowej

CTD

i

N -

końcowej

Forma aktywna,

hiper-P –

pol II

O

związana z

elongacją

transkrypcji

Forma

nieaktywna,

hypo-P –

pol II

A

związana z

inicjacja

transkrypcji

Stopień

ufosforylow

ania

domeny

CTD

koreluje z

aktywną lub

nieaktywną

jej formą

Domena

CTD

wchodzi w

skład RPB1 i

zawiera

powtórzenia

sekwencji :

Tyr-Ser-Pro-

Thr-Ser-Pro-

Ser

Schemat promotora genu eukariotycznego :

Wiązanie receptora GR do genu :

na przykładzie steroidowy receptor GR <

glukokortykoidowy >

Wiązanie receptorów GR do DNA ; pomagają one regulować

ekspresję genetyczną :

•

Wykorzystano komórki, do których wprowadzono MMTV ze
znakowanymi białkami GFP białka GRIP-1 oraz pol II.
Białka GRIP-1 – glucocorticoid receptor interacting protein-
1

•

Następnie sprawdzano dynamikę zachowań białek GRIP-1,
receptorów GR i pol II pod wpływem hormonu sterydowego
– dex ( dexamethasone )

•

Wykorzystano w tych badaniach metodę FRAP i iFRAP

Wykrywanie co–lokalizacji GFP-GRIP-1 z nowopowstałym

transkryptem MMTV ( mouse mammary tumor virus ) metodą

FISH’a :

Analiza dynamiki białek GRIP-1 metodą FRAP w komórkach

MMTV :

Porównanie dynamiki lokalizacji białek GRIP-1 oraz receptora

GR :

Wnioski :

• Intensywność odzyskiwania świecenia, a tym

samym dynamika zachowania GRIP-1 oraz GR
jest wizualnie nie do odróżnienia

• Białka GRIP-1 nie ograniczają dynamiki

zachowania GR

Wyniki co-lokalizacji pol II z nowopowstałym transkryptem

MMTV – z użyciem metody FISH’a :

Wyniki analizy dynamiki pol II metodą FRAP :

Wnioski :

• Tempo odzyskania fluorescencji w miejscu

wypalenia, wynikające z wędrówki pol II, różni się
zasadniczo od tempa dynamiki białek GRIP-1 lub
receptora GR

• Czas jaki potrzebuje pol II na przemieszczenie się

do wypalonego miejsca jest o wiele dłuższy niż w
przypadku białek GRIP-1

• Dla białek GRIP-1 czas ten wynosi 5s, natomiast

dla pol II 13 min

Badanie dynamiki GFP-pol II metoodą iFRAP :

Polimeraza II – frakcje :

•

Z użyciem metody FRAP

stwierdzono istnienie dwóch

frakcji polimerazy II :

 Wolna = zaangażowana w

przebieg procesu

transkrypcji

 Szybka = mobilna, nie

wykazująca aktywności

transkrypcyjnej

 Poza tymi dwiema

frakcjami, które były

znakowane białkami GFP, w

komórkach tych istnieje

również pula polimerazy II

endogennej - nie

znakowanej

Wpływ sarkosylu na dynamikę endogennej pol II – użycie

metody radiolabeling :

•

Sarkosyl jest to detergent

służący do wyekstrahowania

transkryptu związanego z DNA

•

Nowopowstały transkrypt,

który jest odporny na działanie

sarkostylu początkowo

wykazuje bardzo zbliżoną

kinetykę do kinetyki totalnego

RNA, lecz po pewnym czasie

staje się nasycony

•

Okres półtrwania wynosi 14

min co jest spowodowane

tempem inicjacji i elongacji

przy czym tempo inicjacji i

terminacji muszą być sobie

równe

•

Okres półtrwania pol II na

matrycy wynosi również 14 min

Miejsce polimerazy II w cyklu transkrypcyjnym :

• Fakcja szybka pol II

stanowi 75 % całej
puli plimerazy II,
natomiast pol II
zaangażowana 25 –
27 %.

• Pol II zaangażowana

jest to pol II
elongacyjna

Wnioski:

•

Liczba aktywnych transkrypcyjnie kompleksów rośnie po
dodaniu ligandu – hormonu

•

Jest to naturalna odpowiedz komórki na potraktowanie
jej hormonem niezależnie od poziomu ekspresji pol II

•

Rekrutacja pol II na promotorze jest wprost
proporcjonalna do ubytku polimerazy na promotorze

•

Zastosowanie technik : photobleaching, analizy Fish’a,
metody FRAP, iFRAP, FLIP ujawniły dużą dynamikę białek
wiążących się na promotorze, zarówno GRIP-1, jak i
receptorów GR

•

Dynamika zachowań białek GRIP-1 na matrycy jest
proporcjonalna do dynamiki zachowań receptorów GR, a
tym samym nie są one zdolne do wizualnego odróżnienia

•

Zadziałanie na komórkę hormonem i jego złączenie z

GR, powoduje wzrost aktywności rekrutacji czynników

transkrypcyjnych na promotorze

•

Dynamika zachowań GRIP-1 oraz GR wpływa na

inicjację transkrypcji

•

Pol II i GRIP-1 różnią się tempem dynamiki, co jest

dowodem na wysoko dynamiczną naturę zdarzeń

mających miejsce podczas inicjacji

•

Czas potrzebny do przemieszczenia się białek GRIP-1

do miejsca wypalonego jest równy 5s, natomiast dla pol

II wynosi 13 min, a więc tempo dynamiki białek GRIP-1

jest większe

•

Użycie sarkostylu potwierdziło, że zarówno znakowana

pol II (egzogenna ), jak i endogenna zachowują się

podobnie czyli wykazują zbliżoną dynamikę

Klasyczny pogląd na ekspresję genów :

Obecny pogląd na ekspresję genów :

• Elementem integrującym procesy dojrzewania mRNA jest C-końcowa

domena polimerazy II. CTD zawiera wiele reszt aminokwasowych,
które ulegają odwracalnej fosforylacji podczas cyklu transkrypcyjnego.
Pol IIA, forma hypofosforylowana, jest składnikiem kompleksu
preinicjacyjnego, a jej fosforylacja i przekształcenie w
hiperfosforylowaną pol IIO powoduje rozpoczęcie elongacji.

• Tworzenie czapeczki, splicing oraz poliadenylacja mogą

zachodzić także niezależnie od transkrypcji, co zostało
zaobserwowane w eksperymentach in vitro oraz in vivo.
Jednak przebiegające kotranskrypcyjnie zachodzą z
większą specyficznością i wydajnością.

INICJACJA TRANSKRYPCJI

KOMPLEKS INICJACYJNY

Budowa miejsca terminacji transkrypcji :

AG

AAUAAA

WYZNACZENIE OSTATNIEGO
EGZONU

RNA

SYGNAŁ POLI(A)

MIEJSCE PAUZUJĄCE

TERMINACJA TRANSKRYPCJI

CUGGCGGCGG

UUUUUUUUUUUUUUU

DOJRZEWANIE 3’ KOŃCA
CIĘCIE/POLIADENYLACJA

CA

G/U

AATAAA

DN
A

CA

G/T

MIEJSCE PAUZUJĄCE

TERMINACJA TRANSKRYPCJI

CTGGCGGCGG

TTTTTTTTTTTTTTTTT

Czynniki tworzące kompleks

poliadenylacyjny :

• CPSF

– czynnik specyficzności cięcia i poliadenylacji - wiąże się z

sekwencją AAUAAA, stymuluje przyłączenie się polimerazy poli(A)

(PAP)

• PAP

– polimeraza poli(A) - niezbędny składnik kompleksu

poliadenylacyjnego

• CstF

– czynnik stymulacji cięcia - wiąże się z sekwencją G/U,

stymuluje przyłączenie się CF I i CF II

• CF I

i

CF II

– czynniki cięcia I i II - tną transkrypt w obrębie

nukleotydu A z dinukleotydu CA

• CTD

– domena C-końcowa polimerazy II - uczestniczy w formowaniu i

funkcjonowaniu stabilnego, aktywnego katalitycznie kompleksu

dojrzewania przez bezpośrednie interakcje z czynnikami poliadenylacji.

AG

AAUAAA

CA

G/U

SYGNAŁ POLI(A)

CIĘCIE

UUUUUUUU

CUGGCGGCGG

Przebieg poliadenylacji:

• przyłączenie CPSF i CstF do odpowiednich sekwencji
• oddziaływanie w/w czynników powoduje przyłączenie

się PAP i CF I i CF II

• cięcie w obrębie nukleotydu A
• dołączanie ogona poli(A) wspomagane przez PABP II

Terminacja transkrypcji a poliadenylacja :

• Mutacje sekwencji poli(A) pozwoliły na wykrycie związku

poliadenylacji z terminacją transkrypcji.

• Podobny efekt wywołują zmiany w ilości reszt T na końcu 3’

oraz mutacje w miejscu cięcia.

AATAAA

DN
A

CA

G/T

MIEJSCE PAUZUJĄCE

TERMINACJA TRANSKRYPCJI

CTGGCGGCGG

TTTTTTTTTTTTTTT

AAGAAA

CA

G/T

MIEJSCE PAUZUJĄCE

TERMINACJA TRANSKRYPCJI

CTGGCGGCGG

TTTTTTTTTTTTT

MUTACJA

POL

POL

Model terminacji transkrypcji :

• model „torpedy” -

cięcie transkryptu w
obrębie dinukleotydu
CA jest
zasygnalizowane
polimerazie przez
działanie 5’ - 3’
egzonukleazy, które
szybko degraduje
produkt 3’cięcia, co
powoduje, że
polimeraza staje się
skłonna do
oddysocjowania od
matrycy DNA

•

Po przejściu pol IIO przez sygnał poli(A), rozpoczyna się tworzenie
kompleksu poliadenylacyjnego. CPSF i CstF opuszczają CTD i
przyłączają się do odpowiednich sekwencji.

•

pol II chwilowo zatrzymuje się w miejscu pauzującym, co daje CTD
więcej czasu na oddziaływanie z pozostałymi czynnikami kompleksu.
Oddziaływanie to jest możliwe dzięki wygięciu transkryptu pre-mRNA
w dużą pętlę.

•

Po całkowitym uformowaniu kompleksu dochodzi do
endonukleolitycznego cięcia i rozpadu kompleksu.

•

Następuje stopniowa defosforylacja CTD, spowalniająca bieg pol II.
Dodatkowo działanie egzonukleazy trawiącej produkt 3’ powoduje
terminację i oddysocjowanie pol II od matrycy.

•

Pozwala to na reinicjację transkrypcji i rozpoczęcie nowego cyklu
transkrypcyjnego.

ELONGACJA

TERMINACJA

miejsce pauzujące

Mechanizm zależnej od białek reinicjacji

transkrypcji :