FILTRACJA ŻELOWA, CHROMATOGRAFIA JONWYMIENNA,

CHROMATOGRAFIA ODDZIAŁYWAŃ HYDROFOBOWYCH,

CHROMATOGRAFIA POWINOWACTWA

Karolina Boik

Małgorzata Gałdyszyńska

Marta Owczarek



Czym jest?



Faza stacjonarna



Faza ruchoma



Wykorzystuje różną wielkość cząsteczek



Stosowane żele: dekstran, aragoza lub poliakryloamid
(typowa średnica ziaren 100µm=0,1mm).



Mieszaninę białek w

małej objętości nakłada

się na kolumnę

wypełnioną porowatymi

ziarnami żelu. Duże

białka wypływają

wcześniej od małych,

ponieważ nie mogą

wniknąć do wnętrza

ziaren żelu.



Wykorzystuje różnicę w ładunku wypadkowym odmiennych
cząsteczek

Etapy eksperymentów

jonowymiennych

1.Równoważenie

2.Aplikacja i oczyszczanie

3.Eluacja

4.Regeneracja

Ogólna charakterystyka

• Oddziaływania

elektrostatyczne

• Prawo Coulomba

Wartość siły zależy od:
1.

Wartości wypadkowego

powierzczniowego ładunku

biomolekuły oddziałującej

z gr. funkcyjnymi złoża

2.

Gęstości ładunku

jonowymieniacza

3.

Siły jonowej środowiska

4.

Rodzaju jonów obecnych w

środowisku



Siła jonowa



Rodzaj jonu lub jonów wypierających



Wartość pH



Rola w procesie retencji białek na
jonowymiennych kolumnach
chromatograficznych.



Wartość pH przy której wypadkowy ładunek

cząsteczki białka wynosi zero.



pH<pI uprotonowanie grup aminowych

polikation



pH>pI odczepienie protonów grupy

karboksylowej polianion



Oddziaływania różnych białek ze złożem
jonowymiennym są zróżnicowane, wynika
to z niewielkich zmian ładunków na
powierzchni cząsteczki białek.



W roztworze o pH=pI, wypadkowy ładunek
białka wynosi 0, lecz różna lokalizacja
zjonizowanych reszt aminokwasowych
wewnątrz polipeptydu może wywołać
różnice w potencjale elektostatycznym na
jego powierzchni



Wąski zakres siły jonowej, powyżej której
ma miejsce desorpcja wszystkich białek ze
złoża chromatograficznego powoduje
powszechne polecanie stosowania
gradientu elucyjnego (0,5 mol/l lub 1mol/l
stężenie soli) w celu efektywnego
rozdzielenia mieszaniny białek.



Dość duży problem



Należy eksperymentalnie określić
specyficzność kationów i anionów względem
izolowanego białka



Porównanie czasów retencji tego białka
uzyskanych podczas jego elucji roztworami
zawierającymi różne przeciwjony.



Słaby anionit



Silny anionit



Słaby kationit



Silny kationit

Pojęcie silny/słaby oznacza jedynie

wpływ pH na stan jonizacji grup
funkcyjnych.



Uniwersalne złoże chromatograficzne

stosowane w chromatografii

jonowymiennej



Charakteryzuje się wysoką selektywnością



Katonit zawierający sulfopropylowe grupy

funkcyjne



Wydajny rozdział białek o charakterze

zarówno zasadowym i

obojetnym(trypsynogen, cytochrom c,

lizozym), jak i o charakterze kwasowym

(oksydaza łuszczowa, beta-amylaza)



Ważny czynnik określający retencję białek
na jonowymiennych kolumnach
chromatograficznych



Obok siły jonowej buforu



Zaleca się stosować rozpuszczalniki
organiczne (20%) aby zredukować
oddziaływania hydrofobowe.



Słabe (LiCl, NaF)



Pośrednie NH4Cl)



Silne (NaBr, MgCl2)



Preferowane pośrednie w celu uzyskania
wydajnego procesu oczyszczenia białek.

Hydrfobic Interaction Chromatography, HIC



HIC polega na indukowaniu

interakcji (wysoką siłą

jonową fazy ruchomej)

pomiędzy powierzchnią

białka a słabo hydrofobowym

ligandem złoża



Niedenaturujące warunki w

trakcie elucji pozwalają

zachować strukturę

trzeciorzędową białka



Ligand fazy stałej (złoże krzemionkowe)
powinien być dobierany pod kątem
rozdzielanych białek



Siła adsorpcji białek wzrasta zgodnie z
kolejnością ligandów złoża:

Hydroksypropyl <propyl <benzyl <izopropyl
<fenyl <pentyl



Sorpcja białek zależy od charakteru
liotropowego jonów fazy ruchomej
(warunkujących precypitację), i ich
stężenia



Przy doborze soli należy się kierować
także jej właściwościami fizycznymi i
chemicznymi



Charakter liotropowy soli zmniejsza się
zgodnie z kolejnością ligandów:

Na

2

SO

4

 > K

2

SO

4

 > (NH

4

)

2

SO

4

 > NaCl > NH

4

Cl >

NaBr > NaSCN



Wartość pH wpływa na jonizację grup
aminokwasowych, która to z kolei wpływa
na siłę oddziaływań hydrofobowych. Grupy
te posiadając ładunek wiążą cząstki wody,
co jest równoznaczne ze zwiększeniem
hydrofilności białka. Gdy ładunek
wypadkowy spada, wzrasta siła adsorpcji
białek do złoża.



Dodanie do fazy mobilnej rozpuszczalnika
organicznego sprzyja desorpcji białek.



1. Równoważenie fazy stacjonarnej do
pożądanych startowych warunków (poprzez
dodawanie odpowiedniej soli do fazy
mobilnej)



2. Dodawanie próbki i wymywanie
Celem w tym etapie jest
wiązanie cząsteczek docelowych i
wypłukanie całego niezwiązanego
materiału. Wiązanie jest promowane przez
umiarkowanie wysokie stężenie soli.



3. Elucja cząstki uwalniane są z
hydrofobowej powierzchni przez zmianę
składu buforu. Najczęstszą drogą jest
obniżanie gradientu stężenia soli w buforze



4. Regeneracja usuwanie wszystkich
molekuł wciąż związanych. Zapewnia to
pełną zdolność fazy stacjonarnej i
dostępność do następnego użycia.



http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp01
077.nsf/AttachmentsByTitle/HIC/$FILE/GE_Hy
drophobic+Interaction.swf

GE_Hydrophobic+Interaction.swf

Reversed- Phase Chromatography, RPC



Podobnie jak HIC wykorzystuje
oddziaływania hydrofobowe między cząstką
białka a ligandem hydrofobowej fazy stałej,
siła oddziaływań jest jednak większa (ligand
jest bardziej hydrofobowy).



Faza mobilna używana w wymywaniu w
wielu przypadkach niszczy strukturę
trzeciorzędową białka (tracą aktywność)



Najczęściej stosowane- wypełnienie
siloksanowe (faza związana typu Si-O-Si-C)
z podstawnikiem C

8

-C

18

.

Długość łańcucha dobierana jest do

substancji rozdzielanej, przy dłuższych
ligandach i w obecności denaturującej fazy
ruchomej może dojść do nieodwracalnej
adsorpcji białka do złoża.

acetonitryl (preferowany, oprócz

rozdzielania protein o charakterze

silnie hydrofobowym)

izopropanol

1.

T – wzrost wydajności

rozdziału w temp 20-60°C

2.

pH- niskie przyczynia się

do denaturacji białek, co

zwiększa efektywność

rozdziału

wysokocząsteczkowych i

hydrofobowych białek

3.

Związki chaotropowe- (np.

mocznik, chlorowodorek

guanidyny) denaturują i

rozpuszczają białka,

zwiększają wydajność i

efektywność rozdzielania

1.

Rybonukleza,
Papaina,
Syntetyczne
peptydy, Kolagen

2.

Papaina,
Cytochrom C

3.

Glikopeptyd

Ion-pairing środki, są często stosowane w RPC

do blokowania ładunku przez co ładunek
cząsteczek próbki jest mniej hydrofobowy.



Kwas fosforowy- powszechnie stosowany w RP-
HPLC, względnie słaby odczynnik typu ion-pairing



Kwas trifluorooctowy (TFA)- pośrednie właściwości
ion-pairing



Kwas mrówkowy- zalecany do stosowania dla
białek trudno rozpuszczalnych, kiedy to TFA jest
nieskuteczne



1. Równoważenie-kolumna

hydrofobowa jest

przygotowywana poprzez

zastosowanie specyficznego

buforu próbki;



2. Dodawanie próbki i

wymywanie- białka próbki

są nanoszone na kolumnę.

Białka w mieszaninie które

mają wysoki procent

eksponowanych

hydrofobowych reszt

aminokwasów będą

absorbowane do

hydrofobowej fazy

stacjonarnej. Inne białka w

mieszaninie będą wymyte;



3. Elucja- Najczęstszym sposobem na to

jest użycie gradientu, który powoli zwiększa

hydrofobowość za pomocą organicznego

rozpuszczalnika. Kolejność, w której białka

są desorbowane jest zazwyczaj relatywna

do liczby zewnętrznych reszt

hydrofobowych każdego białka;



4. regeneracja- Ten etap polega na

zmyciu pozostałych białek z fazy

stacjonarnej i powrót do warunków, jakie

były na początku procesu. 

4



http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp0
1077.nsf/AttachmentsByTitle/RPC/$FILE/GE_
Reversed+Phase.swf

GE_Reversed+Phase (1).swf

•

Jedna z wielu technik chromatograficznych

•

Unikatowa – wykorzystuje specyficzne
powinowactwo dwóch substancji
biologicznie czynnych

•

Zmniejszona liczba procedur

•

Wyodrębnienie białek – zwłaszcza
enzymatycznych

•

Użyteczna przy białkach których
oczyszczenie jest trudne lub niemożliwe.

ziarno z
kowalencyjnie
związanym
substratem

związana
cząsteczka
białka

inne nie wiązane
białka

bisorbent

Ligand

Specyficznoś

ć

NAD, NADP

Dehydrogenaz

y

Białko G

Przeciwciała

Arginina

Fibronektyna,

protrombina

Heparyna

Lipoproteiny

W tej chromatografii duże znaczenie ma

nośnik, który jest stosowany. Wypełniacz
kolumn powinien mieć następujące
właściwości:



Hydrofilowość



Strukturę makroporowatą



Sztywność struktury



Obojętność chemiczną



Stabilność chemiczną

NOŚNIK

NIEAKTYWOWANY

AKTYWOWANY

może być
przystosowan
y do celów
chromatografi
i we własnym
zakresie

spotykana w
handlu, obejmuje
nośniki specjalnie
przygotowane do
wiązania z
ligandem



Aktywność bisorbentu można znacznie

podwyższyć przez zmianę odległości miedzy

ligandem i nośnikiem



Długość tego wiązania ma

znaczenie dla małych ligandów



Duży ligand wiązany z małym białkiem nie

wymaga takiej grupy dystansowej



Przy dużym białku obecność takiej grupy jest

wskazana



Grupy takie eliminują efekty steryczne nośnika



PRZYŁĄCZANIE LIGANDU



Należy zwrócić uwagę na efekty steryczne i
grupę dystansową



Stężenie ligandu



Wielkość ligandu



stabilność



USUNIĘCIE NADMIARU LIGANDU



Tris lub etanoloamina



Kwas octowy



PRZEMYCIE BUFOREM

Na tak przygotowaną kolumnę możemy
nałożyć próbkę

Białka są rozpuszczone w buforze
fosforanowym lub w 0,1-0,2M Tris

Jest to zazwyczaj też bufor elucyjny

Obecność 0,1-0,5M NaCl jest wskazana w
buforze elucyjnym



Jeden z rodzajów chromatografii
powinowactwa



Szybkie i wydajne oczyszczanie białek



Mechanizm opiera się na oddziaływaniach
pomiędzy grupami funkcyjnymi
aminokwasów (-OH, -NH

2

, -SH) i

immobilizowanym jonem metalu.



Znaczenie niektórych aminokwasów



Zastosowanie tej techniki do frakcjonowania
białek



Najczęstsze wypełniacze to:

•

Agaroza

•

Krzemionka

•

Związki polimerowe o charakterze
hydrofilowym

Do nich przyłączone są

związki chelatujące



IDA

–kwas iminodioctowy



TED

–tris(karboksymetylo)etyleno-diamina



NTA

–kwas nitrylotrioctowy

W tej chromatografii ważny jest też
dobór metalu. Najczęściej stosowane
to: Cu(II),Ni(II), Ca(II), Zn(II), Fe(II),
Fe(III), a także Al(III), Ga(III), In(III),
Tl(III)

Możliwość usunięcia chelatowanego metalu z
kolumny i zastąpienie go innym wyróżnia tą
chromatografię spośród innych chromatografii
powinowactwa. Usunięcie tego metalu
zachodzi przy użyciu EDTA

–kwas

etylenodiaminotetraoctowy

•

Selektywność wiązania białek z jonami

metali zależy od pH fazy ruchomej

•

Mapy retencji w celu określenia

optymalnego pH

•

Dodanie związku adsorbującego do

koordynacyjnego miejsca na powierzchni

białka lub substancji konkurujących z

białkami

pH=7

pH>7

pH<7

Ni(II) może
preferować
siarkę
cysteiny i
azot
histydyny

Fe(III) ma
tendencję
do wiązania
się z siarką i
z tlenem
grup -COOH



Stosuje się roztwory wodne zawierające
sole, związki powierzchniowo czynne,
mocznik, rozpuszczalniki organiczne



Obecność NaCl w fazie ruchomej powoduje
wzrost adsorpcji i selektywności



Rozpuszczalniki organiczne wykazują
właściwości wzmacniające silne
oddziaływania i osłabiające słabe

Białko

Metal

Kolagenaza

Zn(II)

Fibrynogen ludzki

Zn(II)

Somatotropina

Cu(II)

Perforyna

Co(II)

Białka wyizolowane techniką IMAC