Elektroforeza

jako technika

separacji

makrocząstecz

ek

Ćwiczenia dla grupy specjalizacyjnej Anna Bzducha

ELEKTROFOREZA - zjawisko elektrokinetyczne,

ELEKTROFOREZA - zjawisko elektrokinetyczne,

w którym pod wpływem przyłożonego pola

w którym pod wpływem przyłożonego pola

elektrycznego dochodzi do przemieszczania się

elektrycznego dochodzi do przemieszczania się

makrocząsteczek obdarzonych ładunkiem

makrocząsteczek obdarzonych ładunkiem

elektrycznym

elektrycznym

Prędkość przemieszczania

się naładowanej elektrycznie

makrocząsteczki zależy od:

- ładunku
- rozmiaru makrocząsteczki
(masa)
- kształtu
- oporów środowiska, w którym
makrocząsteczka się porusza

Ćwiczenia dla grupy specjalizacyjnej Anna Bzducha

OBSZARY ZASTOSOWANIA

OBSZARY ZASTOSOWANIA

ELEKTROFOREZY:

ELEKTROFOREZY:

-

biochemia białek i kwasów nukleinowych

biochemia białek i kwasów nukleinowych

-

biologia molekularna

biologia molekularna

-

farmakologia

farmakologia

-

medycyna sądowa

medycyna sądowa

-

diagnostyka medyczna

diagnostyka medyczna

-

kontrola jakości żywności

kontrola jakości żywności

Ćwiczenia dla grupy specjalizacyjnej Anna Bzducha

Genomika

Genomika

Wykorzystanie technik

Wykorzystanie technik

elektroforetycznych umożliwiło

elektroforetycznych umożliwiło

uzyskanie pełnej sekwencji DNA

uzyskanie pełnej sekwencji DNA

człowieka – techniki

człowieka – techniki

sekwencjonowania DNA w

sekwencjonowania DNA w

końcowym etapie opierają się

końcowym etapie opierają się

o elektroforezę

o elektroforezę

Przyłożenie pola elektrycznego do wodnego
roztworu
elektrolitu zawierającego makrocząsteczki
obdarzone ładunkiem elektrycznym (makrojony)
powoduje ruch jonów- zarówno elektrolitu jak i
makrojonów w kierunku elektrody o przeciwnym
ładunku elektrycznym

PODSTAWY TEORETYCZNE

ELEKTORFOREZY

Zarówno jony proste jak i jony makrocząsteczek
w środowisku wodnym występują w postaci uwodnionej –
posiadają otoczkę hydratacyjną (uporządkowany układ
dipoli wodnych związanych z jonem słabymi siłami
elektrostatycznymi). Zasięg tego uporządkowania wpływa na
możliwość ruchu jonów i makrojonów
w otaczającym środowisku. Właściwości otoczki zależą od
rozmiaru jonu, jego ładunku elektrycznego i właściwości
elektrolitu (pH, siła jonowa).

Równocześnie z procesami elektorforezy

(ruchu jonów i makrojonów w polu elektrycznym

zachodzącym w objętości elektrolitu)

zachodzą

procesy elektrolizy – proces zachodzący

przy powierzchni elektrod polegający na

odkładaniu się na elektrodach substancji

pochodzących z elektrolitu pod wpływem

przepływającego prądu.

Siła jonowa-

stężenia funkcja jonów (przy

zbyt wysokim stężeniu jonów następuje

ograniczenie ich ruchliwości i spadek

przewodności elektrycznej. Występuje on

również przy zbyt niskim stężeniu jonów

(niedobór nośników ładunku elektrycznego)

Wartość pH- miara stężenia jonów wodorowych w elektrolicie
– ma szczególne znaczenie w odniesieniu do białek i peptydów
(amfotery), bowiem w zależności od pH środowiska obdarzone
sa wypadkowym ładunkiem dodatnim, ujemnym lub 0 (punkt
izoelektryczny).

Przeważająca większość ładunku elektrycznego białek
pochodzi z zależnej od wartości pH jonizacji bocznych
łańcuchów karboksylowych oraz grup[ aminowych (inaczej w
przypadku kwasów nukleinowych- zawsze mają ładunek
ujemny).

Aby elektroforetyczna separacja białek była skuteczna
konieczne jest utrzymywanie stałej wartości pH elektrolitu. Z
uwagi na zachodzącą w sposób ciągły elektrolizę wody -
generowanie jonów H

+

(katoda) i OH

- (

anoda) elektrolit musi

być buforowany.

AMINOKWASY i BIAŁKA

AMINOKWASY i BIAŁKA

Ładunek cząsteczki białka zależy od:

- składu aminokwasów
- pH środowiska

Ładunek może być (+) lub (-)

lub (0)

Rodzaje nośników elektroforetycznych

Rodzaje nośników elektroforetycznych

Rozdziały elektroforetyczne mogą być

prowadzone

bezpośrednio w objętości

elektrolitu

(elektroforeza kapilarna) lub

w

nośniku elektroforetycznym

wypełnionym

odpowiednim elektrolitem. Nośnik

elektroforetyczny –

bibuła, azotan celulozy,

agaroza, poliakrylamid

stabilizuje elektrolit i

przyczynia się do lepszej separacji cząsteczek na

zasadzie sita molekularnego (agaroza,

poliakryamid)

.

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym

PAGE

PAGE

Żel poliakrylamidowy (kolor szary) z „tunelami -
kanalikami” (różnej wielkości czerwone pierścienie z
zacieniowaną na jasno głębią). Należy zauważyć, że w żelu
jest wiele kanalików o różnej wielkości

Elektroforeza PAGE

Elektroforeza PAGE

Żel poliakrylamidowy przygotowany jest z

monomerów akrylamidu i substancji sieciujących

(cross –linkers). Właściwości sieciujące ma

bisakrylamid. Reakcję polimeryzacji inicjuje się,

np. chemicznie (np. nadsiarczyn amonu z

katalizatorem TEMED).

Gęstość usieciowania oraz rozmiary porów w żelu

można modyfikować stężeniami akrylamidu i

bisakrylamidu.

Elektroforeza PAGE

Elektroforeza PAGE

Rzut z góry na

widok dwóch

wybranych

kanalików

(pokazano

tylko dwa, aby diagram

był bardziej czytelny).

Tunele te

rozciągają się

przez całą długość

żelu, nie są to

kanaliki

rozpostarte w linii

prostej (są kręte)

Różna średnica

kanalików.

Rodzaje komór elektroforetycznych

Rodzaje komór elektroforetycznych

Ze względu na sposób

umieszczenia nośnika

elektroforetycznego

można wyróżnić:

-

elektroforezę

kapilarną

- elektroforezę

pionową

- elektroforezę

poziomą

Schemat urządzenia do elektroforezy

Schemat urządzenia do elektroforezy

pionowej

pionowej

Schemat urządzenia do elektroforezy

Schemat urządzenia do elektroforezy

Rodzaje elektroforezy

Rodzaje elektroforezy

• Elektroforeza strefowa

(stała wartość pH

elektrolitu)

• Izotachoforeza

(nośnik o nieciągłym pH)

• Ognioskowanie izoelektryczne

(pH

zmienia się od wartości najwyższej przy katodzie do

najniższej przy anodzie)

• Elektroforeza natywna

–

makrocząsteczki

pozostają niezdenaturowane

• Elektroforeza w obecności SDS

• Elektroforeza nieciągła

(żele zagęszczający i

rozdzielający)

• Elektroforeza dwukierunkowa (2D)
• Immunoelektroforeza
• Sekwencjonowanie DNA

Elektrof.
strefowa

Elektroforeza SDS- PAGE

Elektroforeza SDS- PAGE

Elektroforeza białek "natywnych" jest stosowana bardzo

rzadko

SDS- PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (SDS -
PAGE)

Sól sodowa siarczanu dodecylu = SDS

(Sodium Dodecyl Sulfate = Sodium Lauryl Sulfate)

CH

3

(CH

2

)

11

SO

3

-

Na

+

detergent posiadający w swej cząsteczce region

hydrofobowy = ogon CH

3

(CH

2

)

oraz grupy hydrofilowe: SO

3

-

Na

+

,

co sprawia, że ma właściwości amfifilowe.

Elektroforeza SDS - PAGE

Elektroforeza SDS - PAGE

- bardzo silny detergent, który denaturuje białka

poprzez

dołączanie się do szkieletu polipeptydowego

- badania wskazują, że większość białek przyłącza

1.4 g SDS/g białka z kilkoma wyjątkami, np.
białka

błon komórkowych (membran) mogą przyłączyć

więcej

SDS, bo są bardziej hydrofobowe

=> Ładunek kompleksu SDS-białko

determinowany jest przez SDS => (-1) ładunek

dla każdej cząsteczki SDS

- ilość przyłączonego SDS zależy od wielkości białka –
wszystkie micelle białko/SDS są anionami

=>

ładunek jest wprost proporcjonalny do masy

M

Elektroforeza SDS - PAGE

Elektroforeza SDS - PAGE

Nanoszenie próbki i rozdział

Nanoszenie próbki i rozdział

elektroforetyczny

elektroforetyczny

Elektroforeza SDS - PAGE

Elektroforeza SDS - PAGE

Elektroforeza SDS - PAGE

Elektroforeza SDS - PAGE

Mieszanina

zdenaturowanych

białek (różowe linie o

różnej długości), które

rozpoczynają

„wędrówkę” przez żel

poliakrylamidowy

(szary z kanalikami).

Układ znajduje się w
polu elektrycznym (-

+). Ponieważ wszystkie

zedenaturowane SDS-

em białka posiadają

silny ładunek ujemny

poruszają się w

kierunku przyłożonego

ładunku dodatniego

Elektroforeza SDS - PAGE

Elektroforeza SDS - PAGE

Schemat żelu poliakrylamidowego
po rozdziale elektroforetycznym
białek:
Linia 1: standard mas molekularnych –

czasteczki o znanej masie

molekularnej
Linia 2: mieszanina trzech białek o
różnej wielkości cząsteczek a –
największe białko,
c najmniejsze

białko

Linia 3: białko a
Linia 4: bialko b
Linia 5: białko c

Należy zauważyć, że każde z białek,
niezależnie czy naniesione na żel
indywidualnie czy w mieszaninie,
przebywa zawsze tę samą drogę
Standard mas molekularnych jest
stosowany w celu pomiaru relatywnej
wielkości nieznanego białka (a, b, i c)

Elektroforeza SDS - PAGE

Elektroforeza SDS - PAGE

Po rozdziale frakcje

białek pozostałe na

żelu poddaje się

barwieniu