IZOLOWANIE ENZYMÓW

 METODY POZWALAJĄCE NA OTRZYMANIE JEDNORODNYCH PREPARATÓW

BEZ UTRATY AKTYWNOŚCI KATALITYCZNEJ:

1. ROZDROBNIENIE TKANEK W HOMOGENIZATORZE
2. EKSTRAKCJA (WODĄ LUB ROZCIEŃCZONYMI ROZTWORAMI SOLI O

WARTOŚCIACH PH ODDALONYCH OD PUNKTU IZOELEKTRYCZNEGO

3. ODDZIELENIE ENZYMÓW MOCNO WBUDOWANYCH W ZIARNISTOŚCI

KOMÓREK LUB BŁONY KOMÓRKOWE (ZAMRAŻANIE I ODMRAŻANIE,
EKSTRAKCJA BUTANOLEM, EKSTRAKCJA

DETERGENTAMI)

4. FRAKCJONOWANIE (WYTRĄCANIE SIARCZANEM AMONU, ACETONEM,

ETANOLEM I ETEREM W NISKIEJ TEMPERATURZE)

5. KRYSTALIZACJA (DOSYCENIE R-REM SIARCZANU AMONU, DIALIZA WOBEC

WODY)

• IZOLACJA ZWYKLE W ZAKRESIE pH 5-9

• UNIKAĆ DENATURACJI CIEPLNEJ I MECHANICZNEJ

• UNIKAĆ INAKTYWACJI SOLAMI METALI CIĘŻKICH

OKREŚLANIE AKTYWNOŚCI

ENZYMATYCZNEJ

JEDNOSTKI AKTYWNOŚCI ENZYMÓW:

1 JEDNOSTKA (1 UNIT) – to taka ilość enzymu, która
w standardowych warunkach katalizuje powstawanie lub
rozpad 1mikromola substratu/produktu w ciągu 1 min

• 1 KATAL (1KAT)– to taka ilość enzymu, która w

standardowych warunkach przekształca 1 mol substratu
w ciągu 1s (jednostka zgodna z układem SI)

1 kat = 6∙10

7

U

1 U = 16,67∙10

-9

kat = 16,67 nkat

OZNACZANIE ENZYMÓW

• pomiar ilości enzymu w stanie czystym –

często trudne do osiągnięcia i
czasochłonne

• pomiar aktywności enzymu – na podstawie

szybkości katalizowanej reakcji
uzyskujemy informację o ilości enzymu (bo
szybkość ta jest proporcjonalna do ilości
enzymu)

• Jeżeli enzym otrzymano w stanie czystym

to można oznaczyć jego aktywność
właściwą w jednostkach na mg białka lub
molekularną w jednostkach na 1 mmol

STANDARYZACJA OZNACZANIE

ENZYMÓW

• stosowanie jednej jednostki aktywności reakcji

enzymatycznej - katali

• stosowanie szczegółowo opisanych metod
• aktywność enzymu musi być stała w czasie oznaczania
• mierzona aktywność enzymu musi być proporcjonalna

do rozcieńczenia próbki

• zakres roboczy metody musi odpowiadać zakresowi

wielkości aktywności enzymu mierzonej w
laboratorium

• reakcję enzymatyczną należy zawsze prowadzić

w standardowej dla danego enzymu temperaturze

ENZYMY-UKŁADY

POMIAROWE

Testy optyczne

1. Kolorymetryczne analogi naturalnych substratów
a. Fosfatazy ( p-nitrofenylofosforan, a-naftylofosforan
b. Amylaza (p-nitrofenylo-D-maltoheptozyd, 2-chloro-p-

nitrofenylo-aD-maltotriozyd

2. Substancje, z których pod wpływem enzymów powstają barwne

produkty reakcji (3,3’,5,5’-tetrametylobenzydyna (TMB))

Testy immunologiczne
(oparte o przeciwciała – metody immunoturbidymetryczne,

radioimmunologiczne, immunoenzymatyczne)

ENZYMY – WARTOŚĆ

DIAGNOSTYCZNA

Enzym

Główne źródła

enzymu we krwi

Zastosowanie kliniczne

Aminotransferaz
a alaninowa

Wątroba

Chroroby miąższowe wątroby

Aminotransferaz
a
asparaginianowa

Wątroba, mięśnie
szkieletowe, serce,
erytocyty

Choroby miąższowe wątroby,
choroby mięśni

Fosfataza
alkaliczna

Wątroba, kości,
błona śluzowa jelit,
łożysko

Choroby kości, choroby dróg
żółciowych

Amylaza

Trzustka, ślinianki

Choroby trzustki

Cholinesteraza

Wątroba

Zatrucie związkami
fosforoorganicznymi,
nadwrażliwość na
suksametonium, choroby
miąższowe wątroby

Kinaza
kreatynowa

Mięśnie
szkieletowe, serce

Choroby mięśni (zawał serca)

g-
glutamylotransfe
raza

Wątroba

Choroby dróg żółciowych,
marker nadużycia alkoholu

Dehydrogenaza
mleczanowa

Serce, wątroba,
mięśnie
szkieletowe,
erytrocyty, płytki,
węzły chłonne

Hemoliza, choroby miąższu
wątrobowego, marker
nowotworowy

Lipaza

Trzustka

Choroby trzustki

5’-Nukleotydaza

Wątroba

Choroby dróg żółciowych

OZNACZANIE WYBRANYCH

ENZYMÓW

AMINOTRANSFERAZY
ALT: alaninowa (EC 2.6.1.2 Transferaza L-alanina:2-ketoglutaran)
AST: asparaginianowa (EC 2.6.1.1 Transferaza L-asparaginian:
ketoglutaran)
katalizują reakcję przeniesienia grupy aminowej
równowaga reakcji przesunięta w kierunku tworzenia
alaniny/asparaginianu
PLP (fosforan 5’-pirydoksalu) – koenzym
ALT – występuje w cytoplazmie
AST – występuje w cytoplazmie i mitochondrium (5-10%
aktywności AST w surowicy osób zdrowych)

 
Znaczenie kliniczne
aminotransferaz
Wzrost aktywności:
choroby wątroby:

- wirusowe zapalenie wątroby
- alkoholowe zapalenie wątroby
- toksyczne zapalenie wątroby
- marskość wątroby
- przerzuty do wątroby
- inne

zawał mięśnia sercowego
dystrofie mięśniowe

Metoda oznaczania aminotransferaz

Wg Reitmana i Frankela

Zasada metody:
Powstające w reakcji transaminacji ketokwasy przeprowadza się w
fenylohydrazony, które w środowisku alkalicznym wykazują
brunatnoczerwone zabarwienie

2,4-dinitrofenylohydrazyna

a-Ketoglutaran

GAMMA-GLUTAMYLOTRANSFERAZA (GGT)
EC 2.3.2.2 Glutamylotransferaza peptyd g-glutamylowy:aminokwas

•związana z błonami plazmatycznymi komórek

- mikrosomy
- w błonach komórkowych (transport aminokwasów lub peptydów w poprzek błony)

•enzym działa wyłącznie na peptydy lub związki peptydopodobne zawierające
końcową resztę g-glutamylową (przyłączoną do reszty związku za pośrednictwem węgla g)

Fizjologicznie katalizuje przeniesienie reszty
g-glutamylowej z glutationu lub innego
peptydu g-glutamylowego na akceptor, którym
może być aminokwas lub peptyd

Zasada oznaczania GGT

Rozmieszczenie tkankowe GGT
nerki - kanaliki proksymalne
wątroba
trzustka
jelita
 
Znaczenie kliniczne GGT
Wzrost aktywności:
choroby związane z zastojem w drogach odprowadzających:

- choroby wątroby i dróg żółciowych
- choroby trzustki

indukcja lekami

- barbiturany, fenytoina, estrogeny
- alkohol (wskaźnik abstynencji - 2–5 tygodni)

pierwotny rak wątroby
przerzuty innych nowotworów do wątroby
 
Metody oznaczania GGT
metoda kolorymetryczna – procedura rekomendowana przez IFCC:

- L-g-glutamylo-3-karboksy-4-nitroanilid (pochodna GGPNA) – donor
- glycyloglicyna – akceptor
- produkt – 5-amino-2-nitrobenzoesan (410 nm)

FOSFATAZA ALKALICZNA (ALP)
EC 3.1.3.1 Zasadowa fosfohydrolaza monoestrów ortofosforanowych
katalizuje hydrolizę wielu naturalnych i syntetycznych substratów (w
środowisku alkalicznym)
enzym jest związany z błonami

- na zewnętrznej powierzchni błony komórkowej
- związany z białkami i fosfolipidami błonowymi

Mg

+2

, Co

+2

, Mn

+2

– aktywatory

Zn

+2

wchodzi w skład cząsteczki enzymu (metaloenzym)

inhibitory: fosforany, borany, szczawiany, cyjanki
bufory: obojętne (węglanowy, barbitalowy); hamujące (glicynowy,
propyloaminowy); aktywujące (TRIS, dietanoloaminowy)
 
Rozmieszczenie tkankowe ALP
błona śluzowa jelita cienkiego
nerki - kanalik proksymalny (kręty)
kości – osteoblasty
wątroba
łożysko

Znaczenie kliniczne ALP
W osoczu osób zdrowych występują izoformy – wątrobowa, kostna i jelitowa
(nie u wszystkich osób)
 
Fizjologiczny wzrost aktywności:
u ciężarnych – izoenzym łożyskowy
dzieci – izoforma kostna
osoby z grupą krwi B i O po posiłku – izoenzym jelitowy
kobiety w okresie menstruacji – izoenzym jelitowy
doustne leki antykoncepcyjne – izoenzym jelitowy
 
Patologiczny wzrost aktywności
choroby wątroby – izoforma wątrobowa
pierwotne i wtórne choroby kości – izoforma kostna

- choroba Pageta
- osteomalacja
- krzywica
- osteoporoza postmenopauzalna
- nowotwory kości

pierwotna i wtórna nadczynność przytarczyc – izoforma kostna
nowotwory - produkcja ektopowa izoenzymów łożyskowego, jelitowego i
komórek zarodkowych

Oznaczenia aktywności ALP
metoda kolorymetryczna

- substrat fosforan 4-nitrofenylu (PNPP)
- produkt – jon 4-nitrofenoksydowy (405 nm)
- IFCC rekomenduje użycie buforu AMP (aminometylopropanolowego)
- rekomendowana temperatura oznaczenia 37°C

surowica bez hemolizy
na czczo (dieta ubogotłuszczowa)

Oznaczanie izoenzymów i izoform ALP
Właściwości wykorzystywane w celu różnicowania izoenzymów i izoform:

•ruchliwość elektroforetyczna

•wrażliwość na czynniki denaturujące – temperatura (izoforma kostna), czynniki chemiczne

•wrażliwość na działanie selektywnych inhibitorów (mocznik – izofoma kostna;
L-fenyloalanina – izoenzym jelitowy i łożyskowy)

•powinowactwo lektynowe

•właściwości immunochemiczne – indukowanie produkcji specyficznych przeciwciał

AMYLAZA (AMY)
EC 3.2.1.1 Glukanohydrolaza 1,4-a-D-glukanu
hydrolizuje wiązania a-1,4-glikozydowe w łańcuchach polisacharydowych
metaloenzym – wymaga obecności Ca

+2

dla zachowania swojej aktywności

aktywatory – jony Cl

-

, Br

-

, NO

3

-

, HPO

4

-2

, cholanowe

optymalne pH: 6,9 – 7,0
54-62 kDa
jedyny enzym osoczowy fizjologicznie obecny w moczu
 
Rozmieszczenie tkankowe AMY
izoenzym S - produkowany w śliniankach (obecny w ślinie)
izoenzym P - produkowany w trzustce (obecny w soku trzustkowym)
aktywność AML jest także stwierdzana w:

- nasieniu, nasieniowodach
- jajnikach, jajowodach
- mięśniach poprzecznie prążkowanych
- płucach
- tkance tłuszczowej
- siarze
- łzach
- mleku
- płynach z otrzewnej i opłucnej

izoenzymy P i S podlegają modyfikacjom potranslacyjnym (glikozylacja,
deaminacja, deglikozylacja) – powstaje wiele izoform

Znaczenie kliniczne AMY
Wzrost aktywności:
zapalenie trzustki
- w ostrym zapaleniu wzrost aktywności po 5-6 godzinach od pierwszych
objawów -> maksimum po 24 godzinach -> powrót do wartości
prawidłowych po 3-4 dniach
zapalenie ślinianek
pozatrzustkowe choroby w jamie brzusznej

- choroby dróg żółciowych
- niedrożnośc jelit
- zapalenie krezki
- perforacja wrzodu żołądka
- zapalenie błony śluzowej żołądka i dwunastnicy
- pęknięcie tętniaka aorty
- ostre zapalenie wyrostka robaczkowego
- zapalenie otrzewnej

choroby układu moczowo-płciowego

- pęknięcie jajowodu (ciąża pozamaciczna)
- nowotwór jajnika
- niewydolność nerek

Oznaczenie aktywności AMY przy zastosowaniu odczynnika
Krisman

Zasada metody: Glikogen tworzy z jodem kompleks o brunatnym
zabarwieniu. W wyniku rozkładu glikogenu przez alfa-amylazę powstają
dekstryny o różnej wielkości cząsteczek i następuje zanik zabarwienia, co
wykorzystuje się w oznaczeniu kolorymetrycznym.

Trypsyna /E.C. 3.4.4.4/

Należy do endopeptydaz o funkcji trawiennej zawierającej w swoim centrum
katalitycznymi serynę. Prekursor trypsyny, trypsynogen wydzielany w
trzystce przekształcony jest w jelicie cienkim w trypsynę, białko o ciężarze
cząsteczkowym 24kD i optimum pH 7-9. Trypsyna rozcina wiązania utworzone
przez reszty karboksylowe argininy i lizyny.

Oznaczanie aktywności trypsyny
Do oznaczania akywności trypsyny używa się:
1. Białka (np. kazeiny)
2. Syntetycznych amidów, pochodnych argininy (np.benzoilo-DL-arginylo p-

nitroanilid /BAPNA/

Wykonanie:

Roztwory:
1. Substrat- BAPNA rozpuścić przez ogrzewanie do 85C w 0,1 M Tris-HCl

pH=8,2

2. Roztwór hamujący enzym-10% kwas octowy
3. Roztwór standardowy: szereg rozcieńczeń p-nitroaniliny 1cm3=1mikro

mol p-nitroaniliny

4. Badany r-r zawierający trypsynę

Reakcję prowadzi się w 25C przez 10 min. Poprzez zmieszanie roztworów
substratu z enzymem,
Następnie reakcję zatrzymuje się przez dodanie kw. Octowego. Gęstość
optyczną odczytuje się wobec próby ślepej (bez dodania enzymu) przy
410nm.
Wyniki pomiarów porównuje się do krzywej standardowej wyznaczonej przez
pomiar gęstości szeregu rozcieńczeń r-ru standardowego.

Oznaczanie inhibitora trypsyny

Zasada polega na pomiarze spadku aktywności trypsyny podczas krótkiej
inkubacji z surowicą krwi, zawierającą inhibitor trypsyny. Oznaczenie polega
na porównaniu aktywności w obecności i przy braku inhibitora i wyliczenie
ilości trypsyny zahamowanej.

Oznaczenie glukozy przy pomocy glukozydazy

E.C.1.1.3.4

Zasada metody: Glukozydaza jest enzymem, który utlenia glukozę do
glukonolaktonu z wytworzeniem nadtlenku wodoru. Peroksydaza utlenia
o-dwuanizydynę (DH2) tlenem pochodzącym z H2O2. DH2 przekształca
się w brunatny barwnik (D), który bada się kolorymetrycznie, a jego ilość
jest proporcjonalna do ilości glukozy w próbie.

+ H

2

O

2

+ H

2

O

+O

2

H

2

O

2

+ DH2

2H

2

O + D