Odwrotne transkryptazy

 Odwrotna transkryptaza (rewertaza) jest to polimeraza

DNA zależna od RNA.

 Posiada 3 rodzaje aktywności:
1. Aktywność polimerazy DNA zależnej od RNA.
2. Aktywność rybonukleazową .
3. Aktywność polimerazy DNA zależnej od DNA.
 Za jej odkrycie w 1975 roku przyznano nagrodę Nobla.
 Rewertaza występuje u retrowirusów (np. HIV) i niektórych

wirusów DNA (Hepadnawirusy).

 Odwrotna transkryptaza kodowana jest przez

retrotranspozony (specyficzna cząsteczka RNA)
występujące w genomie organizmów eukariotycznych.

Struktura krystalograficzna

odwrotnej transkryptazy HIV-1

Centrum

aktywne

Podjednostka

Centrum aktywne

Podjednostka

Odwrotne transkryptazy służące

w RT- PCR:

 RT HIV-1
 Telomeraza
 RT M-MLV

Inhibitor RT HIV-1

 Inhibitorem RT HIV-1 jest azydotymina,

zapobiega ona replikacji i wstrzymuje syntezę
łańcucha DNA.

 Jest jednym ze składników koktajlu inhibitorów

używanych w terapii wielolekowej AIDS.

Inhibitor RT HIV-1

Telomeraza

• Telomeraza- enzym o aktywności polimerazy DNA

zależnej od RNA. Jego zadaniem jest dobudowanie 3’
końcowego odcinka DNA na nici opóźnionej (

synteza

telomerów

). W ten sposób zabezpiecza strukturę DNA

przed skracaniem się.

• Telomeraza jest wyjątkowo aktywna podczas rozwoju

embrionalnego. Jej ekspresja w komórkach somatycznych
obniża się jednak w parę tygodni po narodzinach.

• Z jej mutacjami związane są takie choroby, jak: wrodzona

dyskeratoza, anemia plastyczna, idiopatyczne włóknienie
płuc. Schorzenia te są wynikiem występowania zbyt
krótkich i dysfunkcyjnych telomerów.

Telomeraza

RT M-MLV

 RT M-MLV (Moloney murine leukemia virus)

monomeryczny enzym wyizolowany z mysiego
wirusa leukemii (białaczka spowodowana np.
działaniem retrowirusów).

 jest rekombinowaną polimerazą DNA , która

syntezuje nowy łańcuch DNA z pojedynczej nici
RNA, DNA, bądź hybrydy DNA- RNA (dwuniciowa
cząsteczka kwasu nukleinowego DNA + RNA
połączone na zasadzie komplementarności).

RT M-MLV

Real-time PCR

 Reakcja łańcuchowa polimerazy DNA z analizą

ilości produktu w czasie rzeczywistym (ang. real-
time PCR); czuła metoda analityczna stosowana
w genetyce.

 Główne cechy real time PCR:

a. umożliwia jednoczesne namnażanie DNA oraz

monitorowanie ilości produktów powstających
podczas kolejnych cykli (amplikonów),

b. czułość
c. metoda jest znacznie mniej czaso- i

pracochłonna,

d. szeroki zakres oznaczanych stężeń oraz wysoka

powtarzalność uzyskiwanych wyników

e. wysoki koszt analizy i drogi sprzęt

W skład mieszaniny reakcyjnej

standardowej reakcji PCR wchodzą:

• oligonukleotydowe primery
• nukleotydy będące substratami
• bufor

zapewniający

odpowiednie

środowisko reakcji

• jony magnezu
• termostabilna

polimeraza

DNA:

polimeraza Taq (Thermus aquaticus),
Pfu DNA polimeraza (Pyrococcus furiosus).

Fluorescencja

• Dzięki zjawisku fluorescencji real- time PCR pozwala

śledzić proces namnażania się DNA w czasie rzeczywistym i
tym samym oznaczyć ilości produktu w fazie jego
wykładniczego wzrostu.

Wartość C

• Cykl, w którym sygnał fluorescencji osiągnął wartość

graniczną pozwalającą ma jego wykrycie (ang. threshold
cycle C

). Od cyklu progowego rozpoczyna się wczesna

faza logarytmiczna PCR.

Im więcej kopii powielanej sekwencji obecnych jest
w próbie w momencie rozpoczęcia reakcji, tym
mniej

cykli

potrzeba,

aby

intensywność

fluorescencji przekroczyła poziom tła.

Znaczniki do

fluorescencji:

 specyficzne (zależne od sekwencji

nukleotydów), np. wygaszacze i
reportery w sondach TaqMan (wyg.:
TAMARA rep.: 6-
karboksyfluoresceina) i typu „spinka
do włosów”.

 niespecyficzne (niezależne od

sekwencji nukleotydów; wykorzystują
barwniki wiążące się z DNA) np.
SYBR Green I, bromek etydyny

Metody specyficzne

• z użyciem barwników specjalnie zaprojektowanych i

zsyntetyzowanych dla danej sekwencji. Zasada ich
działania opiera się na rezonansowym transferze
energii fluorescencji (FRET) pomiędzy cząsteczką
donora i wygaszacza.

1. Liniowe sondy oligonukleotydowe/ sondy sąsiadujące

(ang. dual hybridisation probes/adjacent probes).

2. Sondy ulegające reakcji hydrolizy, czyli fluorescencja

wykorzystaniem

aktywności

5’-nukleazowej

polimerazy (np. TaqMan).

3. Sondy o strukturze spinki do włosów (ang. hairpin

oligoprobes).

Sondy liniowe

• Metoda z użyciem pary fluorescencyjnych sond

oligonukleotydowych, emitujących sygnał jedynie
wtedy, gdy zbliżają się do siebie w wyniku
przyłączenia się do matrycy DNA.

Sonda TaqMan

• Jest to krótki odcinek DNA wyznakowany cząsteczką

fluorescencyjną na końcu 5’ oraz związkiem wygaszającym
na końcu 3’. Gdy znajdują się one w bliskim sąsiedztwie,
tzn. obie są przyłączone do tego samego oligonukleotydu,
wygaszacz pochłania sygnał emitowany przez reporter.
Podczas amplifikacji oligonukleotyd ulega rozdzieleniu
dzięki aktywności 5’ egzonukleazowej polimerazy DNA
Taq. Reporter i wygaszacz zostają rozdzielone i w ten
sposób zostaje uwolniony sygnał fluorescencji.

Najpowszechniejsze wygaszacze:
• TAMARA, DABCYL, BHQ.
Najpopularniejsze reportery:
• FAM, VIC, NED oraz pochodne fluoresceiny (np. izotiocyjanian

fluoresceiny, 6-karboksyfluoresceina)

Sonda TaqMan

 Zalety:

• wysoka specyficzność,
• wykrywają ewentualne mutacje punktowe

zachodzące podczas powielania prób.

 Wady:

• wysoki koszt metody.

Sondy typu „spinka do włosów”

 Dzięki

obecności

tych

sondach

komplementarnych

sekwencji

wewnętrznych,

ich

drugorzędowa

struktura

przybiera

charakterystyczną

postać spinki do włosów, która jest
niszczona podczas amplifikacji. Powoduje
to rozdzielenie reportera i wygaszacza, a
zatem wyzwolenie sygnału fluorescencji,
który wcześniej był rozpraszany w postaci
ciepła.

Molecular Beacon

 jako

pierwsza

rt-PCR

wykorzystuje

pojedynczą sondę o kształcie spinki do
włosów, której część osiowa (stem) zawiera
komplementarne do siebie odcinki, a pętla
(loop) – sekwencje komplementarne do
sekwencji DNA.

 Z sondą są związane dwie cząsteczki –

fluorochrom znajdujący się na końcu 5’ i
wygaszacz zlokalizowany na przeciwległym
końcu.

Istota MB

• Zamknięta struktura tej sondy utrzymuje

fluorochrom i wygaszacz w bliskim sąsiedztwie,
co powoduje, że przy odpowiedniej długości fali
świetlnej nie dochodzi do emisji światła. Dzieje się
tak dlatego, że wygaszacz, który znajduje się w
bezpośredniej odległości od wzbudzonego
fluorochromu przechwytuje jego energię,
uniemożliwiając emisję.

• Sonda ulega rozpleceniu w przypadku napotkania

sekwencji w pełni komplementarnej do sekwencji
wewnętrznej sondy. Następuje wówczas oddzielenie
reportera i wygaszacza oraz emisja fluorescencji.

Molecular Beacon

 Zalety:

• jedno z najczulszych narzędzi służących do

wykrywania mutacji, ponieważ kompleks sonda-
matryca musi być termodynamicznie stabilniejszy
niż struktura spinki do włosów,

• duża specyficzność względem powielanego

fragmentu.

 Wady:

• występowanie niedopasowań (ang. mismatch)

pomiędzy sekwencją sondy, a powielanym
fragmentem. Prowadzi ono do destabilizacji
dupleksu sonda-matryca.

Fluorochrom SYBR Green I –

metoda niespecyficzna

• najczęściej stosowany niespecyficzny

barwnik,

• najprostszy i najbardziej ekonomiczny

sposób

detekcję

ilościowe

oznaczenie produktów reakcji rt-PCR,

• metoda wykorzystywana jest do analizy

liczby

kopii

cząsteczek

cDNA

przepisanego z RNA, gdzie dsDNA
będzie produktem reakcji PCR.

SYBR Green I

 Zalety:

• nie wymaga stosowania skomplikowanej

sondy, co znacznie obniża koszty.

 Wady:

• bardziej podatna na błędy. Podobnie jak

bromek etydyny, barwnik ten, interkaluje
do każdej dwuniciowej cząsteczki DNA, w
tym także do dimerów, starterów oraz
niespecyficznych produktów reakcji.