TESTY IMMUNOLOGICZNE

TESTY IMMUNOLOGICZNE

Istnieje wiele odmian testów immunologicznych;
• wszystkie polegają na zajściu reakcji wiązania się antygenu ze swoistymi
(rozpoznającymi go) przeciwciałami,
• różnią się natomiast sposobem wykrywania tej reakcji.

Testy immunologiczne pośrednie
wykrywają immunoglobuliny, które
uprzednio związały się ze swoistym
antygenem.

Opierają się one na na założeniu, że jeśli
organizm kręgowca zetknął się z konkretnym
antygenem, to w surowicy tego organizmu
będą się znajdywały swoiste wobec tego
antygenu przeciwciała. Ponieważ
immunoglobuliny jako takie mają właściwości
immunogenne (wywołują odpowiedź
immunologiczną), można uzyskać swoiste
przeciwciała skierowane wobec
immunoglobulin innego gatunku.

Charakteryzują się większą czułością, gdyż
wykorzystują naturalną zdolność układu
immunologicznego - amplifikację sygnału, jaki
dociera do układu immunologicznego w
postaci antygenu.

BEZPOŚREDNIE

BEZPOŚREDNIE

POŚREDNIE

POŚREDNIE

Testy immunologiczne bezpośrednie
wykrywają określony antygen przy pomocy
znakowanych przeciwciał.

Antygeny wirusowe czy bakteryjne występują jednak
często w ustroju w bardzo niewielkiej ilości, która
znalazła by się poniżej progu detekcji. Z tego względu
często stosuje się testy immunologiczne pośrednie
wykrywające immunoglobuliny, które uprzednio
związały się ze swoistym antygenem.

Aglutynacja
Hemaglutynacja
Precypitacja
Odczyn wiązania dopełniacza

Testy immunoenzymatyczne
Testy immunofluorescencyjne IFA
Testy radioimmunologiczne RIA

Ag + Ab

Ag + Ab

¤

¤

WYNIK

WYNIK

Ag + Ab + Ab

Ag + Ab + Ab

2

2

¤

¤

WYNIK

WYNIK

TESTY SEROLOGICZNE

TESTY SEROLOGICZNE

REAKCJA PRECYPITACJI

REAKCJA PRECYPITACJI

Stężenie antygenu

Ilo

ść

spr

ecy

pi

to

w

an

ych

pr

ze

ci

w

ci

ał

Nadmiar antygenu

Strefa równowagi

Nadmiar przeciwciał

Zachodzi pomiędzy przeciwciałami a rozpuszczalnym antygenem

np. białkiem, wyizolowanym polisacharydem bakterii itp.

Wszystkie testy przeprowadza się w obecności roztworu elektrolitów.

Precypitacja probówkowa

Przeciwciała

W miejscu wytrącania się kompleksów
immunologicznych pojawia się opalizujący
prążek

Rozpuszczalny
antygen

PRECYPITACJA W ŻELU

PRECYPITACJA W ŻELU

Reakcja dyfuzji radialnej wg Manciniego

• służy do ilościowej oceny antygenu

• przeciwciała unieruchomione są w żelu agarowym, antygen dyfunduje

Reakcja podwójnej dyfuzji wg Ouchterlony’ego

• dyfundują cząsteczki antygenu i przeciwciała

Miejsce naniesienia
roztworu antygenu

Pole
precypitacji

Miejsce naniesienia
roztworu antygenu

Miejsce naniesienia
roztworu przeciwciał

Pole

precypitacji

Pole precypitacji jest wprost proporcjonalne
do stężenia antygenu.

Znane stężenia antygenu

x?

a b c

x

st

ęż

enie

antyge

nu

średnica

x

Żel agarowy
zawierający określone
rozcieńczenie przeciwciał

24 h

REAKCJA PODWÓJNEJ DYFUZJI WG OUCHTERLONY’EGO

REAKCJA PODWÓJNEJ DYFUZJI WG OUCHTERLONY’EGO

Pozwala określić czy badane antygeny zawierają identyczne, wspólne, czy też różne
determinanty antygenowe.

Przeciwciała swoiste wobec

określonego antygenu

Badany
antygen

Znany
antygen

A

A

A

B + C

Szybkość dyfuzji antygenu w żelu zależy od jego wielkości
(jest odwrotnie proporcjonalna do masy cząsteczki).

A

Łuk
precypitacji

Przeciwciała

anty-A

Antygeny zawierają różne
determinanty antygenowe

Antygeny zawierają identyczne

determinanty antygenowe

Przeciwciała

anty-A i anty-B

A

B

Antygeny zawierają wspólną

determinantę antygenową

A + B

anty-B

Przeciwciała

anty-A i anty-B

anty-B

Antygeny zawierają różne
determinanty antygenowe

Przeciwciała

anty-A, anty-B i anty-C

anty-B

anty-C

TESTY SEROLOGICZNE

TESTY SEROLOGICZNE

AGLUTYNACJA

AGLUTYNACJA

Najbardziej efektywnymi aglutyninami są IgM.
Aby doszło do porównywalnej aglutynacji antygenu z przeciwciałami IgG,
potrzeba 100 lub nawet 1000 razy więcej cząsteczek IgG.

Zachodzi pomiędzy przeciwciałami a upostaciowanym antygenem.
Reakcję można zaobserwować w postaci „kłaczków”.

Antygen może znajdować się na powierzchni komórek bakteryjnych, eukariotycznych
lub być związany z cząstkami lateksu.

Bakteria

Przeciwciała IgM wiążą się z epitopami
bakterii

HEMAGLUTYNACJA

HEMAGLUTYNACJA

Erytrocyty w roztworze soli fizjologicznej tworzą zawiesinę pojedynczych komórek -
nie zlepiają się. Powierzchnia jest erytrocytu naładowana ujemnie (ze względu na
obecność reszt kwasu sjalowego w błonie komórkowej) i otoczona warstwą kationów.

Erytrocyty, które stosuje się w testach aglutynacji specjalnie przygotowuje się: np.
traktuje się je kwasem taninowym, a następnie inkubuje z antygenem, który adsorbuje
się na ich powierzchni.

Erytrocyty opłaszczone antygem często nazywa się krwinkami „uczulonymi”.

Jeśli w badanej surowicy znajdują
się przeciwciała swoiste wobec tego
antygenu, dochodzi do aglutynacji
erytrocytów.

Jeśli badana surowica nie zawiera
przeciwciał swoistych wobec tego
antygenu, nie dochodzi do aglutynacji
erytrocytów.

krwinki
opadają
na dno

Testy wykorzystujące zjawisko hemaglutynacji:

• odczyn biernej hemaglutynacji

• test hamowania hemaglutynacji

• test Coombsa (odczyn antyglobulinowy)

stosuje się do oznaczania grupy Rh

http://vtpb-www.cvm.tamu.edu/vtpb/vet_micro/serology/titration/fig1.html

Odczyn biernej hemaglutynacji wykorzystuje się do określania miana
przeciwciał.

ODCZYN BIERNEJ HEMAGLUTYNACJI

ODCZYN BIERNEJ HEMAGLUTYNACJI

Miano przeciwciał - rozcieńczenie, przy
jakim nastąpiła hemaglutynacja -
wynosi 1:80

1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 K

aglutynacja

brak aglutynacji

Kolejne rozcieńczenia surowicy

Miano przeciwciał w surowicy
wyznacza dodatnia reakcja
antygen-przeciwciało uzyskana
z najwyższym rozcieńczeniem
surowicy

W przypadku niektórych chorób np. zakaźnych i autoimmunizacyjnych określenie
miana przeciwciał w surowicy może mieć wartość diagnostyczną!
Np. podwyższenie miana może wskazywać na aktywny proces chorobowy.

Obecnie do oznaczenia miana przeciwciała stosuje się inne, nowocześniejsze metody.

SEROKONWERSJA -

pojawienie się

w organizmie przeciwciał skierowanych
przeciwko określonemu antygenowi.

Zmiana statusu serologicznego osoby z
ujemnego do dodatniego.

Typowe dla zakażeń HIV, HBV.

Poziom
przeciwciał

czas

Poziom
detekcji

zakażenie

- - - - + + + +

Pacjent

seronegatywny

Pacjent

seropozytywny

TEST HAMOWANIA HEMAGLUTYNACJI

TEST HAMOWANIA HEMAGLUTYNACJI

Białka niektórych wirusów mają zdolność do zlepiania erytrocytów.

Niektóre hemaglutyniny
wirusowe

• hemaglutynina wirusa
grypy

• hemaglutynina wirusa
odry, świnki i różyczki

erytrocyty

wirusy

aglutynacja erytrocytów

Właściwość ta nie ma nic wspólnego z reakcjami serologicznymi,
jest jednak wykorzystywana w diagnostyce - w teście hamowania
hemaglutynacji.

Erytrocyty przeciwciała wirusy

nie dochodzi do

neutralizujące wirusy

aglutynacji erytrocytów

AGLUTYNACJA KULECZEK LATEKSOWYCH

AGLUTYNACJA KULECZEK LATEKSOWYCH

Komercyjne testy aglutynacji wykorzystują kuleczki lateksu opłaszczone
antygenem lub przeciwciałami.

Wykrywa w surowicy/ plwocinie/ wymazie
pacjenta obecność antygenu.

Kuleczki opłaszczone są przeciwciałami
swoistymi wobec wykrywanego
antygenu.

Wynik pozytywny: aglutynacja

Wynik negatywny: brak antygenu = brak
aglutynacji

lateks

antgen

Test aglutynacji bezpośredniej

Wykrywanie czynnika
reumatoidalnego w surowicy
pacjenta z podejrzeniem
reumatoidalnego zapalenia
stawów

Kuleczki lateksu opłaszczone są
przeciwciałami IgG
skierowanymi przeciw
czynnikowi reumatoidalnemu.

aglutynacja

brak aglutynacji

Wykrywa w surowicy/ plwocinie/ wymazie
pacjenta obecność swoistych przeciwciał.

Kuleczki opłaszczone są określonym
antygenem.

Wynik pozytywny: aglutynacja

Wynik negatywny: brak swoistych
przeciwciał = brak aglutynacji

Test aglutynacji pośredniej

Q

wykorzystują przeciwciała znakowane barwnikami fluorescencyjnymi:

TESTY IMMUNOFLUORESCENCYJNE

TESTY IMMUNOFLUORESCENCYJNE

CDC/Dr. William Cherry

Test immunoflurescencyjny. Bakterie Legionella pneumophila

Cząsteczki barwnika przyłączone są do cząsteczek immunoglobulin kowalencyjnie
(poprzez grupy aminowe lizyny).

FITC

izotiocyjanian tetrametylorodaminy,
po wzbudzeniu emituje kolor czerwony

TRITC

izotiocyjanian fluoresceiny,
po wzbudzeniu emituje kolor zielony

bakteria

przeciwciała znakowane
fluorescencyjnie

Wykrywa w surowicy/ plwocinie/ wymazie
pacjenta obecność antygenu/ bakterii.

Wynik pozytywny: fluorescencja

obserwowana pod mikroskopem
fluorescencyjnym

Wynik negatywny: brak antygenu = brak
fluorescencji

Test immunofluorescencyjny bezpośredni

TESTY IMMUNOFLUORESCENCYJNE

TESTY IMMUNOFLUORESCENCYJNE

Wykrywa w surowicy/ plwocinie/ wymazie pacjenta przy pomocy znakowanych
fluorescencyjnie przeciwciał immunoglobuliny, które uprzednio związały się ze
swoistym antygenem.

Charakteryzują się większą czułością.

Wynik pozytywny: fluorescencja

obserwowana pod mikroskopem fluorescencyjnym

Wynik negatywny: brak przeciwciał = brak fluorescencji

Test immunofluorescencyjny pośredni

Diagnostyka kiły

Wykrywanie autoprzeciwciał

przeciwjądrowych

(układowe schorzenia autoimmunizacyjne)

Dodajemy surowicę pacjenta

www.primer.ru/std/gallery_std/ treponema.htm

Dodajemy przeciwciała

znakowane fluorescencyjnie

przepłukujemy

T. pallidum

Skrawek
tkanki

Krętek kiły

Jądro
komórkowe

https://courses.stu.qmul.ac.uk/smd/kb/pathology
/funmedpics/pathtes2.htm

ANA test

Jeśli pacjent
był/jest zakażony
kiła, obserwuje się
świecenie krętków

Przeciwciała

pacjenta

Przeciwciała

pacjenta

TESTY IMMUNOENZYMATYCZNE

TESTY IMMUNOENZYMATYCZNE

Q

wykorzystują reakcje enzymatyczne do uwidocznienia reakcji

immunologicznej.
Cząsteczki enzymu związane są kowalencyjnie z przeciwciałami lub z biotyną.

Po dodaniu do próbki substratu - chromogenu, enzym przekształca go w barwny
produkt. W miejscu związania się przeciwciał pojawia się kolorowy precypitat.

Testy immunoenzymatyczne charakteryzują się większą czułością niż testy immunofluorescencyjne,
ponieważ jedna cząsteczka enzymu związana z przeciwciałami może katalizować powstanie wielu
cząsteczek produktu.

Najczęściej stosowane enzymy:

•

peroksydaza chrzanowa

• alkaliczna fosfataza

chromogen

kolorowy
precypitat

Najczęściej stosowane substraty:

•

DAB

• AEC

• 4-chloro-1-naftol

Aby zwiększyć czułość reakcji immunoenzymatycznej można stosować przeciwciała
znakowane awidyną (białko jaja kurzego) lub streptawidyną (białko Streptomyces
griseus), które wykazuje silne powinowactwo do biotyny (witamina H). Enzymem
znakuje się wówczas biotynę.

immunoglobulina

z cząsteczką enzymu

Q

wykrywają antygen in situ (w tkankach) - testy immunohistochemiczne

Q

wykrywają antygen lub przeciwciała w roztworze - test ELISA