TECHNIKI MOLEKULARNE wykład nr 9 07.12.2010

Uformowanie kompleksu prereplikacyjnego umożliwia inicjację replikacji, ale tylko w fazie G1 cyklu.

Kontrolowane to jest przez kinazy zależne od cyklin (CDK). Po zakończeniu fazy G1, kinaza defosforyluje

białko Cdc6p, co jest sygnałem do jego degradacji, bądź czasowego usunięcia z obszaru jądra. U wielu Euc.

w fazie S syntetyzowany jest inhibitor tworzenia kompleksu preinicjacyjnego- feminina.

U Euc. inicjacja replikacji nie zachodzi we wszystkich miejscach jednocześnie. Niektóre partie genomu są

zawsze replikowane we wczesnej fazie S, inne w późnej. We wczesnej fazie replikowane są geny ulegające

aktywnej transkrypcji i centromery. Telomery i rejony nietranskrybowane w późnej. Wczesne obszary

replikacji są tkankowo specyficzne.

Badania replikacji chromosomów drożdżowych wykazały

- zawsze najpierw replikowane są centromery, a oba telomery na końcu i jednocześnie

- poszczególne chromosomy replikują na różnych etapach fazy S

- zróżnicowane tempo przemieszczania się widełek replikacyjnych

Nie określono przyczyn tego procesu, nie jest to na pewno wynik wyłącznie sekwencji miejsca inicjacji.

Zjawisko to na pewno zależy od

- położenia miejsca inicjacji na chromosomie

- pozycji miejsca inicjacji w jądrze komórkowym, gdyż miejsca aktywne zwykle sąsiadują ze sobą

- budowa aparatu replikacyjnego u Euc.

Elongacja

Zależna od matrycy synteza DNA może być prowadzona tylko w kierunku 5’-3’ więc jedna nić jest wiodąca

i syntetyzowana w sposób ciągly, druga opóźniona w sposób nieciągly. Drugie ograniczenie- polimerazy nie

są w stanie zaczynać syntezy na matrycy jednoniciowej. Matryca musi mieć choćby bardzo krótki odc.

Dwuniciowy z wolnym końcem 3’OH, co oznacza, że synteza wymaga starterów.

Egzonukleaza 5’-3’ -> naprawa uszkodzeń, usuwanie starterów

Prokariotyczne polimerazy DNA

- Pol. I ->zaangażowana w replikację i naprawę DNA, ma aktywność 3’-5’ egzonukleazy i 5’-

3’egzonukleazy (usuwanie primerów RNA); tempo syntezy 20nt/s

- Pol. II-> naprawa uszkodzonego DNA w fazie G0, ma aktywność 3’-5’ egzonukleazy

- Pol. III-> główna polimeraza bakteryjna, ma tylko aktywność egzonukleazy 3’-5’, tempo syntezy 1000nt/s,

co najmniej 10 podjednostek

- Pol. IV-> synteza DNA w fazie stacjonarnej

-Pol. V-> synteza DNA przy znacznych uszkodzeniach genomu

Eukariotyczne polimerazy DNA

- Pol. α prymaza -> ma aktywność prymazy i syntetyzuje 8-12nt startery RNA, oraz aktywność polimerazy

- Pol. β naprawa DNA

- Pol. γ polimeraza replikująca i naprawiająca mitochondrialne DNA, ma aktywność 3’-5’ egzonukleazy

- pol. δ główna polimeraza replikacyjna, aktywność 3’-5’ egzonukleazy, synteza nici wiodącej

- Pol. ε replikacja nici opóźnionej, kontrola cyklu komórkowego, naprawa DNA, aktywność 3’-5’

egzonukleazy

Podstawą replikacji jest komplementarność zasad azotowych w powstającej 2niciowej cząsteczce. Różnica

w energii swobodnej pomiędzy prawidłowo i nieprawidłowo sparowanymi zasadami jest niewielka. Gdyby

wierność replikacji opierała się tylko na tej zasadzie to pomyłki zdarzałyby się raz na 10^1-10^3 (potęga).

Polimerazy Euc. δ, ε i Proc. Pol. III mylą się raz na 10^6-10^8.

Pozostałe czynniki odpowiadające za wierność replikacji

- w miejscu katalitycznym- brak wody- zwiększa to różnicę energii prawidłowo i nieprawidłowo

sparowanych zasad

- geometria miejsca wiązania obu zasad jest dopasowana do par AT i GC

- poprawia ją obecność dodatkowych białek

- ważna jest korekcyjna aktywność egzonukleolityczna; do źle sparowanego nukleotydu o wiele wolniej

przyłącza się kolejny, więc polimeraza zdąży zadziałać jako egzonukleaza

Elongacja u Procaryota

Dołączenie prymazy do kompleksu preinicjacyjnego prowadzi do formowania prymosomu. Po dołączeniu

do kompleksu polimerazy III w ori powstaje replisom- jednostka replikacyjna zdolna do syntezy zarówno

ciągłej nici wiodącej, jak i opóźnionej. W skład replisomu wchodzą także białka wiążące się do

jednoniciowego DNA-SSB. Torzą one tetrametry, które stabilizują jednoniciowy DNA. Polimeraza III jest

dużym kompleksem zbudowanym z wielu podjednostek, w tym 2 katalitycznych jednostek α

odpowiedzialnych za syntezę nici wiodącej i opóźnionej. Szybkość syntezy wynosi 750nt/s, a długość

syntetyzowanego odcinka to nawet 50tys. nt

Synteza nici opóźnionej odbywa się po zsyntetyzowaniu 1000-2000nt nici wiodącej. Odbywa się ona w

trakcie powtarzających się cykli:

- prymaza wiąże się do helikazy i umiejscawia w widełkach replikacyjnych i syntetyzuje starter (4-15nt.

zaczynając od sekwencji 5’AG3’) na nici opóźnionej

- podjednostki polimerazy III otaczają podwójną helisę utworzoną przez starter i matrycę

- podjednostka katalityczna polimerazy III przemieszcza się z syntetyzowanego poprzednio fragmentu

Okazaki na koniec nowego startera, następuje odłączenie prymazy i rozpoczęcie syntezy nowego fragmentu

(u bakterii te fragmenty mają długość 1000-2000nt)

-po zakończeniu syntezy fragmentu Okazaki starter zbudowany z RNA jest usuwany przez polimerazę I lub

RNAzę H

- luka powstała po usunięciu startera uzupełniana jest przez polimerazę I, a za dawcę wolnego końca 3’OH

służy fragment Okazaki poprzedzający wypełnianą lukę

- połączenie wolnego końca fragmentu zsyntetyzowanego przez polimerazę I z początkiem poprzedniego

fragmentu katalizowane jest przez ligazę

Elongacja u Eucaryota

W replikacji Euc. bierze udział dużo większa liczba białek. Proces podlega również kontroli przez aparat

cyklu komórkowego. Przejście od kompleksu prereplikacyjnego do replikacji jest kontrolowane przez

kinazy zależne od cyklin (CDK) procesem sekwencyjnego dołączania białek potrzebnych do syntezy oraz

białek regulatorowych, a także usuwania białek kompleksu prereplikacyjnego

U Euc. nie stwierdzono odpowiedników replisomu. Zamiast tego enzymy i pozostałe białka tworzą duże

struktury wewnątrzjądrowe, z których każda zawiera setki, nawet tysiące kompleksów replikacyjnych.

Struktury te są związane na stałe z matrix jądrowa, a cząsteczki DNA są przesuwane przez te struktury w

czasie replikacji. Rozmieszczone w miarę równomiernie w całej objętości jądra nazwane zostały fabrykami

replikacyjnymi.

Synteza nici nieciągłej

1. W syntezie DNA u Euc. uczestniczą polimerazy ε, δ, α prymaza

2. Fragmenty Okazaki są krótsze niż u bakterii i mają ok. 180pz, co odpowiada replikacji fragmentu

DNA obejmującego jeden nukleosom

3. Polimeraza α prymaza wytwarza około 10nt odc. RNA do którego dobudowuje 20nt odc. DNA.

Dopiero wtedy następuje przejęcie replikacji przez polimerazę ε lub δ, która kończy syntezę

fragmentu Okazaki. Eukariotyczny fragment Okazaki składa się z 3 części: RNA, DNA

syntetyzowanego przez pol. α i DNA syntetyzowanego przez pol. ε, δ

4. Gdy synteza fragmentu Okazaki dotrze do miejsca startera poprzedniego fragmentu Okazaki,

polimeraza zostaje zastąpiona przez usuwające RNA: flap endonukleazę FEN-1 orz helikazę

endonukleazę Dna2. W usuwaniu RNA uczestniczy również RNazaH1

5. Puste miejsca po primerach RNA zostają wypełnione przez polimerazę, a ligaza I DNA łączy ze sobą

fragmenty Okazaki

Terminacja u Procaryota

Replikacja, która przebiega w 2 przeciwnych kierunkach wzdłuż chromosomu bakteryjnego kończy się, gdy

oba kompleksy replikacyjne dotrą do miejsca terminacji replikacji, do którego wiąże się białko Tus i

zatrzymuje syntezę DNA. U większości prokariotów kończy się, gdy widełki replikacyjne spotykają się ze

sobą.

Terminacja u Eucaryota

W kom. Euc. nie stwierdzono sekwencji odpowiadających sekwencjom terminatorowym u bakterii, ani nie

znaleziono białek o budowie zbliżonej do Tus. Jest bardzo prawdopodobne, że Euc. widełki replikacyjne

mogą się spotykać w miejscach zupełnie przypadkowych. U Euc. kompleksy replikacyjne nie ulegają

rozpadowi w czasie terminacji, gdyż są na stałe wbudowane w strukturę jądra.

Problem topologiczny

- replikacja DNA postępując będzie generować naprężenia (superskręty)

- w DNA liniowym praktycznie nierozwiązywalne ze względu na upakowanie w komórce

- w DNA kolistym absolutnie nierozwiązywalne ze względu na brak wolnych końców

Problemem jest konieczność rotacji cząsteczki DNA, która musi towarzyszyć rozwijaniu helisy. Jeżeli pełny

obrót cząsteczki przypada na każde10 par zasad podwójnej helisy to replikacji jednej cząsteczki DNA np.

ludzkiego chromosomu 1 o długości 250Mb do pełnego rozwinięcia niezbędnych byłoby wykonanie 25mln

obrotów. Jest to niemożliwe na niewielkiej przestrzeni jądra komórkowego, ale byłoby wykonalne dla

cząsteczek liniowych. Dla cząsteczek kolistych-> genomów bakteriofagowych lub bakteryjnych

pozbawionych wolnych końców rotacja jest po prostu niemożliwa.

Dwa typy topoizomeraz

 typu I wprowadzają przecięcie do jednego łańcucha polunukleotydowego i przesuwają drugi łańcuch

przez utworzoną przerwę. Końce przerwanego łańcucha są połączone przez ligazę. Likwidowany jest

w ten sposób tylko jeden skręt

 typu II przecinają oba łańcuchy jednocześnie, likwidowane są 2 skręty

Jeden z końców DNA zostaje zawsze związany z tyrozyną- aminokwasem znajdującym się w centrum

aktywnym enzymu. W komórkach eukariotycznych topoizomerazy stanowią główną część jądrowej matrix.

W trakcie replikacji podczas rozkręcania podwójnej helisy DNA w cząsteczce powstaje pozytywna

superhelisa. Bakterie nie mają topoizomerazy, która potrafi usuwać pozytywną superhelisę. Aby utrzymać

właściwą topologię w sąsiedztwie widełek replikacyjnych inny enzym- gyraza wprowadza do cząsteczki

negatywną superhelisę i neutralizuje w ten sposób napięcie wywołane powstawaniem helisy pozytywnej.

Inna bakteryjna topoizomeraza IV rozdziela powstałe w wyniku replikacji katenany- przeplatające się ze

sobą zamknięte pętle dwóch potomnych cząsteczek chromosomowego DNA

Właściwą topologię w okolicach widełek replikacyjnych u Euc. zapewniają

- topoizomeraza I relaksuje pozytywną superhelisę

- topoizomeraza II rozdziela katenany powstałe w wyniku replikacji

Kopiowanie DNA wg modelu semikonserwatywnej replikacji

- widełki replikacyjne-> sposób dominujący, zarówno bakteryjne chromosomy koliste jak i liniowe Euc.

- przemieszczającej się pętli dla małych cząsteczek kolistych. Np. mitochondria kom. Zwierzęcych. W

miejscu startu tworzy się pierścień D (wielkość ok. 500bp), w którym podwójna helisa ulega rozsunięciu

poprzez włączenie się do niej cząsteczki RNA. Cząsteczka RNA służy jako starter do syntezy jednej z nici

potomnych. Druga nić jest coraz ardziej odsuwana i zostaje zreplikowana dopiero po ukończeniu syntezy

pierwszej nici

- obracającego się koła wykryta u bakteriofaga λ i innych bakteriofagów, jest to bardzo wydajny mechanizm

replikacji kolistych cząsteczek DNA. Replikacja jest inicjowana przez utworzenie przerwy w jednej z nici

rodzicielskich. Powstały wolny koniec 3’ jest wydłużany, a koniec 5’ odsuwany, aby ustąpić miejsca nowo

syntetyzowanej nici, synteza może zachodzić więcej, niż tylko przez jeden obrót . Powstaje w ten sposób

duża liczba cząsteczek połączonych głowa-ogon, które mogą zostać odcięte, a koliste cząsteczki

odtworzone. Do usuniętej nici dosyntetyzowana jest druga nić.