0108; 20.04.2009, cwiczenia nr 8., - Apoptoza.; Paul Esz
Apoptoza
 z greckiego  apoptosis  opadani płatków lub liści z drzew
 naturalna śmierć komórki opisana po raz pierwszy przez Kerra, Wyllie'go i Currie (1972r.)
 zjawisko fizjologiczne niezbędne do prawidłowego funkcjonowania każdego organizmu
 proces aktywny wymagający olbrzymich nakładów energii związanych z aktywacją określonych genów i
inicjacją zdarzeń biochemicznych i strukturalnych
 apoptoza nie wywołuje odczynu zapalnego
 dochodzi do kondensacji chromatyny w obrębie jądra
 fragmentacja DNA
 jądro ulega rozpadowi
 fałdowanie błony komórkowej i tworzenie pączków apoptotycznych
 nic nie przedostaje się na zewnątrz tych pączków dlatego nie ma odczynu zapalnego
 potem te pęczki są fagocytowane
Nekroza
 pęcznienie mitochondriów i lizosomów
 pękanie lizosomów
 chaotyczne cięcie składników cytoplazmy
 zawartość komórki przedostaje się na zewnątrz i powoduje to stan zapalny
 zachodzi pod wpływem dużej dawki silnego czynnika, komórka pęcznieje i tworzy się stan zapalny
Fizjologiczna rola apoptozy
 rola w etapie kształtowania układu nerwowego
 formowanie palców u wyżej uorganizowanych kręgowców
 w trakcie rozwoju układu odpornościowego
 fizjologiczny zanik (inwolucja) grasicy
 naturalna inwolucja narządów i struktur pozostających pod kontrolą układu hormonalnego
 odnowa i regeneracja tkanek
 zakończenie życia komórek zróżnicowanych
Czynniki hamujące i indukujące apoptozę
 biologiczne
 hamujące
 czynniki wzrostu
 estrogeny, androgeny
 niektóre białka rodziny Bel-2 (np. Bel-2, Bel-XL)
 niektóre białka wirusowe (białko adenowirusa E1B)
 białka szoku cieplnego
 onkogeny
 indukujące
 brak czynników wzrostu
 rodzina białek TNF (FasL, TNF)
 niektóre białka rodziny Bel-2 (np. Bax, Bel-Xs)
 produkty limfocytów cytotoksycznych (np. perforyna)
 niektóre hormony (np. glikokortykoidy)
 zakażenia wirusowe (np. HIV)
 geny supresorowe nowotworów (np. p53)
 przerwanie kontaktu z otoczeniem
 jony wapnia
 chemiczne
 hamujące
 inhibitory proteaz cysteinowych
 inhibitory białek promujących apoptozę należących do rodziny bel-2
 inhibitory kalpainy
 indukujące
 leki  (cisplatyna, doksorubicyna, taksol, aspiryna)
 związki toksyczne  (alkohol, cyjanki)
 wolne rodniki tlenowe
 fizyczne
 indukujące
 promieniowanie jonizujące
 wysoka i niska temperatura
Przebieg apoptozy
 faza I
 indukcja lub wzbudzenie (decyzja o śmierci komórki
 działają wtedy czynniki spustowe
 następuje przekazywanie i modyfikacja sygnału z układu receptorowego
 faza II  wykonawcza (śmierć komórki)
 faza III  zniszczenia albo degradacji (kończąca się pochłonięciem komórki przez komórki sąsiadujące lub
makrofagi)
Szlaki sygnalizacyjne apoptozy
Trzy główne szlaki sygnałowe prowadzące do apoptozy
 zewnętrzny (receptorowy)
 wewnętrzny (mitochondrialny)
 indukowany stresem (zamiany w siateczce śródplazmatycznej)  zaburzenia homeostazy jonów wapnia oraz
nagromadzenie nieprawidłowo zmodyfikowanych białek; zmianie ulega kaspaza 12 i aktywuje zmiany w
kaspazach 7 i 8
Poza tym
 szlak pseudoreceptorowy  białko (perforyna) powoduje nieciągłość błony komórkowej  przerywa błonę
komórkową  co umożliwia wniknięcie innego białka (granzym B) do wnętrza komórki co aktywuje kaspazę 3
apoptoza
Kaspazy
Enzymy proteolityczne (rozcinają wiązania peptydowe między aminokwasami)
Mechanizm aktywacji kaspaz
 homoaktywacja (autoproteoliza)
 heteroaktywacja
Trzy grupy
 aktywatory cytokin związane ze stanami zapalnymi (kaspazy: 1, 4, 5, 11, 12, 13, 14)
 inicjatory apoptozy (kaspazy: 8, 9 , 10)
 efektory fazy wykonawczej apoptozy (kaspazy: 3, 6, 7)
Białka trawione przez kaspazy
 białko PARP [polimeraza poli (ADP-rybozy)]
 bierze udział w rozpoznawaniu uszkodzeń i naprawie DNA
 białko ICAD
 proteoliza tego białka uruchamia białko CAD (Caspase-Activated DNAse), którego zadaniem jest cięcie
DNA umierającej komórki
 białko RB (białko retinoblastoma)
 kontroluje przechodzenie komórki przez kolejne fazy cyklu komórkowego
 białko MDM2
 wiąże się z białkiem p53 i reguluje jego stabilność
 Acinus (apoptotic Chromatin Condensation Inducer in the Nucleus)
 odpowiedzialne za kondensację chromatyny jądrowej
 niektóre białka szkieletu komórki np. aktyna i fodryna
 białka wyścielające wewnętrzną powierzchnię otoczki jądrowej  laminy
Rola białka p53 w apoptozie
 uszkodzenie DNA lub innych rzeczy
 dochodzi do wzrostu ekspresji p53 i białko to ma zdolności aktywacji naprawy DNA i wszelkich uszkodzeń w
komórce (aktywuje transkrypcję genów białek naprawy)
 jeśli uszkodzenia są nie duże to zostają naprawione (komóka zostaje zatrzymana w cyklu i się naprawia)
 ponownie wchodzi w cykl komórkowy
 p53 działa jako czynnik naprawy
 gdy zmiany są zbyt duże p53 kieruje komórkę na drogę śmierci
(RYSUNEK I)
Oporność komórek nowotworowych/apoptoza
Elementy obrony komórek nowotworowych przed apoptozą
 zwiększony poziom antyapoptotycznych białek z rodziny Bel-2 (Bel-2 i Bel-XL); nadekspresja Bel-2 hamuje
apoptozę związaną z pobudzeniem receptora TRAIL i komórkach nerwiaków i glejaków
 inaktywacja białek proapoptotycznych z rodziny Bel-2 (Bax, Bak); często jest to związane z mutacjami w
genie białka BAX; ekspresją białka BAX reguluje produkt genu p53
 wzrost ekspresji inhibitorów apoptozy między innymi IAP (inhibitor of apoptosis protein) i FLIP; do białek
IAP należy między innymi surwiwina ( w komórkach nowotworowych obserwuje się wysoki poziom tego
białka)
 uszkodzenie punktów kontrolnych cyklu (między innymi mutacja w obrębie genu p53)
Metoda TUNEL
TUNEL  TdT  mediated deoxyuridinentriphosphate-biotin/digoxygenin nick end-labeling)
TdT  terminalna transferaza
x-dUTP  znakowane nukleotydy
x  znacznik (np. fluorochrom)
Metoda kometkowa (RYSUNEK II)
1. Apoptoza  widoczny po prawej stronie ogon oddalony od głowy
2. Komórka z nieszukodzonym DNA brak ogon
3. Nekroza  ogon połączony z głową
Barwienie aneksyną V i jodkiem propidyny
Aneksyna V wykazuje wysokie powinowactwo do fosfatydyloseryny, dzięki czemu możliwa jest detekcja komórek
wykazujących cechy apoptozy. Jodek propidyny (PI) barwi jądra komórkowe. Przenika do wnętrza komórek, których
ciągłość błony została naruszona. Jest zatem barwnikiem komórek znajdujących się w póz
nej apoptozie lub nekrozie.